多肽類藥物的氨基酸檢測方法

王麗莉

摘 要：多肽類藥物的氨基酸組分測定步驟：多肽的水解方法→衍生→HPLC檢測。簡述多肽藥物的水解方式及衍生方法。

關鍵詞：氨基酸組分；柱前衍生法；多肽藥物

多肽類藥物是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵、二硫鍵連接成一長鏈或環狀結構，常具備α螺旋、β折疊或不規則卷曲的二級結構。多肽的一級結構決定了藥物的高級結構及功能。分析多肽類藥物的氨基酸組成是進行多肽類藥物結構確證不可缺少的部分。氨基酸組成分析的步驟：多肽的水解方法→衍生→HPLC檢測。

1 多肽的水解方法

雖然多肽的氨基酸組成分析方法較多，且趨向更靈敏、更精確、更簡便、更快速，但還沒有一種方法可以單獨適用于所有氨基酸殘基的檢測，并且很多因素如溫度、時間、水解試劑、水解方法及多肽樣品中添加劑等對水解程度均有影響。常用的水解方法作簡要介紹如下：

1.1 酸性水解[1]

酸性水解是應用最為廣泛水解方法，可以使大多數氨基酸殘基完全水解，最通用的水解劑是6 mol/L HCl。

條件：6 mol/L HCl、真空、110℃，水解時間為20～24h。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式。但在該條件下，天冬酰胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸先用二硫代二丙酸、4-乙烯吡啶或碘代乙酸保護后水解方可測定，酪氨酸部分被水解液所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解。有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵難于裂解，可以通過延長水解時間如水解92h甚至120h來解決。

1.2 堿性水解

堿性水解一般選用NaOH和KOH作為水解劑。該水解方法是HCl水解的互補法。因為堿水解時，多數氨基酸遭到破壞或外消旋化，僅色氨酸是穩定的。所以此法僅限于測定色氨酸。

1.3 酶水解

用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對化學水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測定。水解過程中氨基酸不發生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。但是因為酶水解條件溫和，對天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無破壞作用，且反應需要較長的時間，水解不完全，酶本身也是蛋白質，對樣品的測定結果可能會有干擾。

微波輻射能水解，一般情況下190℃微波水解15分鐘肽類即可完全水解，導致完全水解的時間大大縮短。在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時間可從過去的幾十小時縮短到幾十分鐘。

總之，多肽藥物水解方式應根據其產品的性質、研究目的、可獲得的樣品量及少實驗室的具體條件采取適宜的水解方法。

2 衍生

從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反應法和柱前衍生法兩大類。

目前肽類的氨基酸衍生主要以柱前衍生為主。將游離氨基酸經過色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑（茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛）作用。此法比較穩定，對樣品預處理要求低，容易定量和自動化操作，但檢測靈敏度不高，分析時間長。

2.1 柱前衍生法

將氨基酸和化學偶聯試劑先反應生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接檢測衍生物的光吸收或熒光發射。此法可檢測OPA-（鄰苯二甲醛），FMOC，PITC，AQC，DNFB，Dansyl-氨基酸，分析靈敏度高，可利用HPLC進行氨基酸分析，有的衍生物不穩定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測。

多肽藥物的氨基酸組分分析大多數采用柱前衍生。

2.2 PITC柱前衍生氨基酸分析法[2]

本法系根據氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離后用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25？滋mol/ml，本法檢驗操作比較復雜。

2.3 AQC柱前衍生分析法

本法系根據氨基酸與6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜后用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。

2.4 OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法

一級氨基酸與鄰苯二醛（OPA）反應，生成在338nm波長下有吸收的OPA-氨基酸；二級氨基酸與FMOC反應，生成在262nm波長下有吸收的FMOC-氨基酸，生成的氨基酸衍生物通過高效液相色譜分離后用紫外或熒光檢測。

2.5 DNFB柱前衍生氨基酸分析法

本法系根據氨基酸與2，4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離后采用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。除另有規定外，一般不宜采用本法。

2.6 Dansyl-Cl（DNS-Cl）法

熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能與所有氨基酸柱前反應形成高穩定性的帶有熒光的DNS-氨基酸。但反應耗時。

3 結束語

總之，肽類的氨基酸測定可以采用不同的水解方式，采用適宜的衍生方法經行測定，另外隨著質譜技術的廣泛應用，可以采用質譜法測定肽類物質的氨基酸序列，不但可以判定肽類的氨基酸組成還可判定其氨基酸的鏈接順序，使肽類氨基酸的檢測更準確，對肽類物質的結構確證更具意義。

參考文獻

[1]趙成仕，臧愛香，夏蓮.酸水解-全自動氨基酸分析儀測定蜂蜜中17種氨基酸[J]. 現代農業科技，2013年03期.

[2]呂瑩果，張暉，孟祥勇.氨基酸測定及衍生方法[J].糧食與油脂，2009年第07期.