miR-31對人皮膚鱗狀細胞癌生長的影響及作用機制的研究

陳 凱 常東方 段紹坤 李渝涼

皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）是我國常見的皮膚惡性腫瘤，具有高度的侵襲能力，可能與紫外照射損傷、免疫抑制及其他皮膚疾病有關［1］。因此，尋找其發生過程中發揮關鍵作用的分子對其治療是必要的。研究發現微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的發生發展中起著重要的作用［2］。

miRNA是一類比較保守的單鏈非編碼小RNA分子，主要通過與靶基因mRNA 3'UTR結合，在轉錄后水平調控基因的表達［3，4］。miRNA參與一系列的生理過程，如生長、發育、分化及凋亡［5］。研究發現約50%miRNA基因定位于染色體上腫瘤基因相關區域，并且在腫瘤中經常伴隨著miRNA的異常表達［6］。關于miRNA與皮膚鱗癌的研究在國內外報道甚少，有研究表明在皮膚鱗癌中miR-125b通過靶定MMP-13抑制鱗癌細胞的生長和侵襲遷移［7］。此外，通過對皮膚鱗癌和其他皮膚腫瘤患者中miRNA表達水平的分析，發現miR-31在皮膚鱗癌中高表達［8］。然而，關于miR-31在皮膚鱗癌中的作用還未明確。

本研究探索了miR-31對細胞增殖以及腫瘤生長的影響，并對其靶基因進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究20對皮膚鱗癌和癌旁正常組織來自2011年1月至2013年6月重慶醫科大學永川醫院收治患者，并得到患者的知情同意。鱗癌細胞A431和SLC-1的培養液是含有10%FBS的DMEM（Gibco公司）。脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，ASO和siRNA購自上海吉瑪公司。兔抗LATS2和GAPDH抗體購自Abcam公司。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，反轉錄酶購自Fermentas公司，實時定量PCR的2×SYBR Green Master Mix購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 按照脂質體的說明進行。細胞轉染4 h后，換含有血清的培養液，在37℃、5%CO2的孵箱中繼續培養。

1.2.2 平板克隆形成實驗 將轉染的細胞種到12孔板，每隔3天換液至到大部分克隆形成。用PBS清洗后5%濃度結晶紫染色，并進行計數。

1.2.3 體外成瘤實驗 裸鼠購自北京維通利華有限責任公司（動物合格證號：SCXK（京）2013-0002），并得到動物管理委員會的許可。裸鼠在無菌的條件下正常飲食，將106個轉染的鱗癌細胞重懸在100 μL無血清培養液中，經皮下注射途徑植入裸鼠。大概3周后，將小鼠麻醉處死取出腫瘤組織，并量取體積。體積=（長×寬2）/2。

1.2.4 Western印跡 細胞中轉染LATS2的siRNA（20 nM）以及對照，48 h后提取蛋白進行Western印跡分析LATS2的水平。轉染48 h后，用PBS洗細胞后用RIPA緩沖液裂解細胞。利用BCA法進行蛋白濃度測定，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE膠分析。最后利用ECL顯影，并分析條帶的強度。以GAPDH作為內參。

1.2.5 RNA提取和實時定量PCR 利用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用NanoDrop ND-1000分光光度計測定RNA的濃度。取500 ng RNA進行cDNA的合成后進行PCR反應。反應條件是：95℃30 s，之后40個循環95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s。以U6 RNA和β-actin作為內參。

1.2.6 免疫組織化學 將石蠟包埋的組織切片進行脫蠟水合處理，3%H2O2室溫孵育5 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后，用5%山羊血清封閉10 min，滴加一抗工作液孵育1 h。然后用生物素標記的二抗工作液37℃孵育10 min。最后滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗后顯色劑顯色3 min，在顯微鏡下觀察。

1.2.7 GFP報告載體實驗 將含有miR-31結合位點的LATS2 3'UTR克隆到pcDNA3/GFP載體的GFP下游。在細胞中共轉染miR-31 ASO和LATS2 3'UTR，同時轉染RFP質粒作為內參。轉染48 h后，用RIPA裂解細胞提取蛋白，熒光分光光度計檢測細胞GFP熒光強度。

1.3 統計學處理

用SPSS 18.0軟件進行統計分析，比較兩組數據間的差異采用雙側樣本的Student's t檢驗，比較相關性采用Pearson相關系數分析。P＜0.05被認為是差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 平板克隆形成實驗分析miR-31對細胞生長的影響

將miR-31 ASO以及對照轉染A431和SLC-1細胞，利用平板克隆形成實驗檢測細胞生長的情況。轉染miR-31 ASO的A431細胞克隆數較對照組減少約50%，且差異具有統計學意義（P＜0.05）；在SLC-1細胞中也得到了類似的結果。

2.2 體外成瘤實驗分析miR-31對腫瘤生長的影響

將轉染miR-31 ASO以及對照的細胞經皮下注射入裸鼠體內，利用體內成瘤模型檢測miR-31對腫瘤生長的影響。結果顯示轉染miR-31 ASO的鱗癌細胞成瘤能力降低，腫瘤體積明顯小于對照組（圖1），且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 體外成瘤實驗檢測miR-31對鱗癌生長的影響Figure 1 In vitrotumor formation assay indicates that miR-31 inhibition suppresses cSCC growth

2.3 Western blot印跡檢測miR-31對LATS2蛋白水平的影響

研究證實miR-31可以靶定抑癌基因LATS2和PPP2R2A［9］。為了檢測在皮膚鱗癌中miR-31是否也通過這兩個基因發揮作用，首先通過Western印跡檢測miR-31 ASO對LATS2和PPP2R2A表達水平的影響。實驗顯示鱗癌細胞轉染miR-31 ASO后使LATS2的水平升高約1.5倍，差異具有統計學意義（圖2，P＜0.05），而對PPP2R2A的表達水平無影響（P＞0.05）。

2.4 生物信息學預測miR-31的候選靶基因

利用生物信息學方法（TargetScan以及Pictar預測網站）對miR-31與候選靶基因的結合位點進行驗證，圖3顯示miR-31與候選靶基因LATS2 3'UTR的結合位點互補。

圖2 Western blot檢測miR-31對候選靶基因蛋白表達的影響Figure 2 Western blot shows that miR-31 inhibition increases LATS2 protein levels

圖3 生物信息學預測miR-31的靶基因Figure 3 Bioinformatics indicates that LATS2 3'UTR has binding sites with miR-31

2.5 GFP報告載體實驗驗證miR-31的靶基因

在A431和SLC-1細胞中共轉染miR-31 ASO和野生型或者突變型的LATS2 3'UTR（突變位點如圖3所示），通過GFP報告載體實驗檢測miR-31對LATS2 3'UTR熒光強度的影響。結果顯示轉染miR-31 ASO的細胞中LATS2 3'UTR的熒光強度較對照組增強50%（圖4），且差異具有統計學意義（P＜0.05），且在兩種鱗癌細胞中結果一致。然而miR-31 ASO對突變的3'UTR熒光強度無明顯影響（P＞0.05，圖4）。

2.6 Western blot檢測siRNA對LATS2表達水平的影響

在A431和SLC-1細胞中轉染LATS2 siRNA以及對照，轉染48 h后利用Western blot檢測細胞中LATS2蛋白水平。結果顯示轉染LATS2 siRNA的細胞中LATS2的水平較對照組降低約80%，且差異具有統計學意義（圖5，P＜0.05）。

圖4 GFP報告實驗驗證miR-31的靶基因Figure 4 GFP reporter assay shows that miR-31 inhibition increases the GFP intensity of LATS2 3'UTR

2.7 平板克隆形成實驗分析LATS2對細胞生長的影響

在A431和SLC-1細胞中轉染LATS2 siRNA以及對照，利用平板克隆形成實驗檢測細胞的生長情況，結果顯示轉染LATS2 siRNA的細胞克隆數分別升高約70%和1.3倍，且差異具有統計學意義（圖6，P＜0.05）。

2.8 實時定量PCR分析miR-31的表達水平

利用實時定量PCR檢測miR-31和靶基因在鱗癌以及癌旁正常組織中的表達水平。圖7顯示，與癌旁正常組織相比，鱗癌組織中miR-31的水平升高約2.5倍，差異具有統計學意義（P＜0.05），并且miR-31與LATS2的表達呈負相關（P＜0.05）。

2.9 免疫組織化學法檢測LATS2在鱗癌組織中的表達

利用免疫組織化學檢測LATS2在鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達水平。圖8顯示，與正常組織相比，皮膚鱗癌組織中LATS2的表達水平明顯降低。

圖5 Western blot檢測LATS2的表達以及平板克隆形成實驗檢測細胞生長Figure 5 Western blot shows that LATS2 expression is repressed by in?troduction of siRNA against LATS2

圖6 平板克隆形成實驗檢測LATS2對細胞生長的影響Figure 6 Colony formation assay shows that knocking down of LATS2 in?creases the number of colonies

圖7 實時定量PCR檢測miR-31和LATS2在鱗癌組織和正常對照中的表達水平Figure 7 Real-time PCR shows that miR-31 is upregulated in cSCC tis?sues,and an inverse relationship exists between miR-31 and LATS2 ex?pression levels

圖8 免疫組織化學檢測LATS2在鱗癌組織和正常對照中的表達水平（SP×200）Figure 8 Immunohistochemistry shows that LATS2 is downregulated in cSCC tissues（SP×200）

3 討論

本研究結果發現miR-31在鱗癌組織中高表達，抑制miR-31的表達后細胞克隆形成能力下降，腫瘤生長受抑制。已有研究發現miR-31可促進血管平滑肌細胞生長［10］。此外，在食管鱗癌和結腸癌中，miR-31也是高表達，并且與腫瘤的進展程度相關［11-12］，這些均提示miR-31發揮著癌基因的角色。

miRNA與靶基因3'UTR的不完全互補，是導致一個miRNA調控多個靶基因表達的原因之一［13］。研究證實在肺癌和血管平滑肌細胞中miR-31可以通過靶定PPP2R2A和LATS2參與細胞的生長。在本研究中，抑制miR-31的表達后，LATS2蛋白水平升高，而PPP2R2A的表達不受影響。這可能是PPP2R2A的3'UTR在不同的腫瘤細胞中有差異，導致miRNA的抑制作用消失。此外，通過GFP報告實驗進一步驗證LATS2是miR-31的直接靶基因，miR-31通過與其3'UTR直接結合而抑制其表達。

LATS2定位于13號染色體，可編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶。研究發現該酶屬于Hippo腫瘤抑制信號途徑的成員，可以通過磷酸化的形式使癌基因YAP失活，從而抑制惡性間皮瘤細胞的生長［14］。在胃癌中，癌基因miR-372可以通過抑制LATS2的表達從而抑制細胞的生長，促進細胞凋亡［15］。說明LATS2在抑制腫瘤細胞生長中起著重要的作用。本研究通過免疫組織化學及實時定量PCR發現LATS2在皮膚鱗癌組織中表達降低。敲除LATS2的表達后細胞的克隆形成能力增強，與抑制miR-31的作用相反，進一步證實LATS2是miR-31的靶基因。

總之，本研究在皮膚鱗癌中miR-31通過抑制LATS2的表達調控鱗癌的生長，發揮著癌基因的作用，可為皮膚鱗癌的分子治療提供更多的依據和理論基礎。

1 Garcia-Zuazaga J,Olbricht SM.Cutaneous squamous cell carcino?ma[J].Adv Dermatol,2008,24:33-57.

2 Du B,Wang Z,Zhang X,et al.MicroRNA-545 Suppresses Cell Proliferation by Targeting Cyclin D1 and CDK4 in Lung Cancer Cells[J].PloS One,2014,9(2):e88022.

3 Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

4 Dalmay T.Mechanism of miRNA-mediated repression of mRNA translation[J].Essays Biochem,2013,54:29-38.

5 Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004,431(7006):350-355.

6 Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions in?volved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(9):2999-3004.

7 Xu N,Zhang L,Meisgen F,et al.MicroRNA-125b down-regu?lates matrix metallopeptidase 13 and inhibits cutaneous squamous cell carcinoma cell proliferation,migration,and invasion[J].J Biol Chem,2012,287(35):29899-29908.

8 Bruegger C,Kempf W,Spoerri I,et al.MicroRNA expression differs in cutaneous squamous cell carcinomas and healthy skin of immu?nocompetent individuals[J].Exp Dermatol,2013,22(6):426-428.

9 Liu X,Sempere LF,Ouyang H,et al.MicroRNA-31 functions as an oncogenic microRNA in mouse and human lung cancer cells by repressing specific tumor suppressors[J].J Clin Invest,2010,120(4):1298-1309.

10 Liu X,Cheng Y,Chen X,et al.MicroRNA-31 regulated by the ex?tracellular regulated kinase is involved in vascular smooth muscle cell growth via large tumor suppressor homolog2[J].J Biol Chem,2011,286(49):42371-42380.

11 Luo J,Ling ZQ,Peng BF,et al.Expression of miR-31 in esopha?geal squamous cell carcinomaand its relation to prognosis[J].Chi?nese Journal of Cancer,2013,(7):487-492.[羅 君,凌志強,彭兵鋒,et al.MicroRNA-31在食管鱗狀細胞癌中的表達及其與預后的關系[J].中國癌癥雜志,2013,(7):487-492.]

12 Wang CJ,Ma N,Zhou Y.Expression and functions of miR-31 in colorectal cancer tissues and cells[J].Journal of zhengzhou universi?ty(Medical medicine),2013,(5):625-629.[王朝杰,馬 寧,周 云.結直腸癌組織和結腸癌細胞中miR-31的表達及功能[J].鄭州大學學報(醫學版),2013,(5):625-629.]

13 Carroll AP,Goodall GJ,Liu B.Understanding principles of miRNA target recognition and function through integrated biological and bioinformatics approaches[J].Wiley interdiscip Rev RNA,2014,doi:10.1002/wrna.1217.[Epub ahead of print]

14 Murakami H,Mizuno T,Taniguchi T,et al.LATS2 is a tumor sup?pressor gene of malignant mesothelioma[J].Cancer Res,2011,71(3):873-883.

15 Cho WJ,Shin JM,Kim JS,et al.miR-372 regulates cell cycle and apoptosis of ags human gastric cancer cell line through direct regula?tion of LATS2[J].Mol Cells,2009,28(6):521-527.