自體骨髓干細胞移植治療足毀損傷伴重度皮膚缺損的臨床研究

劉儀紅，王普杰，田浩明，周毅，鄧勇（綿陽市解放軍第50醫院糖尿病防治中心,四川綿陽6000，四川大學華西醫院內分泌代謝科，瀘州醫學院附屬醫院泌尿外科）

自體骨髓干細胞移植治療足毀損傷伴重度皮膚缺損的臨床研究

劉儀紅，王普杰，田浩明1，周毅，鄧勇2
（綿陽市解放軍第520醫院糖尿病防治中心,四川綿陽621000，1四川大學華西醫院內分泌代謝科，2瀘州醫學院附屬醫院泌尿外科）

目的:評價自體骨髓間充質干細胞（mesenchymalstem cells,MSCs）移植治療對足毀損傷伴皮膚缺損臨床療效及觀察有無移植相關排異反應和成瘤性。方法:確診的2型糖尿病患者車禍后右足毀損傷伴重度皮膚缺損患者1例,將自體MSCs混懸液注射移植到該患者的足部缺損傷口，術后實時跟蹤傷口恢復情況，并隨訪34個月觀察干細胞移植后致瘤性和修復后的皮膚組織學變化。結果：患者在采用外科常規治療及缺損創面進行了兩次自體皮膚移植等治療64 d無效后，即給予足部皮膚缺損處先后兩次行自體MSCs移植術，術后第3 d開始，患者右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉,皮膚缺損處膿性分泌物開始減少，局部腫脹開始消退,傷口逐漸縮小，第二次術后第36 d傷口痊愈。未出現任何并發癥和不良反應。34個月后隨訪發現，接受MSCs移植的足底局部情況穩定,無移植相關的免疫排斥等并發癥的發生。同時手術切取已愈合傷口的局部皮膚組織，行病理切片檢查發現，與正常皮膚組織病理上無顯著差異，且無成瘤跡象。結論：采用自體MSCs移植治療糖尿病足毀損傷伴皮膚缺損的臨床療效顯著且相對安全，該療法對糖尿病術后及各種外傷所致皮膚缺損的治療提供現實依據和臨床參考。

骨髓間充質干細胞;自體移植;足毀損傷;皮膚缺損；成瘤性

近年來，隨著細胞組織工程學(tissueengineering，TE)的發展，利用骨髓間充質干細胞MSCs的種種優點，用于細胞治療、基因治療以及組織工程的細胞源已成為目前研究的熱點之一[1-2]。2002年，Inaba等[3]和TateishiYuyama等[4]在國際上率先報道了應用骨髓造血干細胞移植治療周圍血管病。目前，動物實驗表明自體骨髓單個核細胞植入缺血的肢體可分化成血管內皮細胞，而促使局部血管形成,均提示了干細胞移植可以用于治療糖尿病肢體缺血性疾病及皮膚嚴重缺損[5-7]。

我們于2011年1月25日起，先后兩次為糖尿病患者車禍后致右足毀損傷伴皮膚缺損實施了自體MSCs移植術,術后對臨床療效、有無移植相關排異反應及成瘤性等并發癥方面進行全面的臨床觀察和研究。現報道如下。

1 材料和方法

1.1 患者基本情況

患者男，59歲，工人，因車禍致右足毀損傷3 h于2010年11月22日以“右足毀損傷”收入我院手足外科住院治療。10年前，在地方醫院確診為“糖尿病”，并長期服用降糖藥物，血糖控制不佳。體格檢查：生命體征平穩。神志清楚，精神欠佳，急性痛苦病容，被動體位，查體欠合作。心肺腹部均未見異常。專科情況：右足可見皮膚挫傷創面約10.0 cm×15.0 cm（見圖1，A），右足背皮膚撕脫，可見大量斷裂的血管神經肌腱，第一楔骨脫位外露，創面挫傷污染嚴重，足背動脈搏動消失，遠端各趾皮色蒼白、無血運。初步診斷：右足血管神經肌腱斷裂；右足背、足底皮膚大面積缺損；右足第一楔骨骨折并脫位；右下肢皮膚大面積挫傷；2型糖尿病。入院后立即急診在硬膜外麻醉下行“清創探查血管神經肌腱修復術、骨折內固定術”，并先后兩次行“自體皮膚移植術”，但術后出現移植皮膚壞死并伴大量膿性滲出物及腥臭味，創面肉芽組織生長緩慢。經過全院專家會診后認為，建議實施右足截肢術，但患者本人不同意而自愿選擇自體干細胞移植術。因此，在我院倫理委員會討論通過及患者簽訂知情同意書后，于2011年1月25日及2011年2月11日，先后2次為患者行自體干細胞移植術。術后第3 d開始，患者右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉,皮膚缺損處膿性分泌物開始減少，局部腫脹開始消退,傷口逐漸縮小，第2次術后第36 d傷口痊愈出院。移植術治療前后，患者血糖控制基本達標（見表1）。

表1 自體骨髓干細胞移植治療前后糖尿病治療方案及血糖監測表

1.2 試劑

淋巴細胞分離液購自上海前塵生物科技有限公司；二甲苯，蘇木精伊紅染液購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM完全培養基購自Invitrogen公司；青鏈霉素購自南京凱基生物發展有限公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 自體骨髓采集

患者完成術前檢查后，在手術當天晨禁食水,在手術室取俯臥位,常規消毒鋪巾,準備好血袋和保養液,局麻下取兩側髂后上棘為采髓部位,沿髂骨上緣外側每隔1cm為一個皮膚進針點進行骨髓采集,每點每次抽吸骨髓10ml,共采集骨髓約50m l。

1.4 骨髓間充質干細胞分離

在無菌超凈臺上將采集的骨髓用2倍量的生理鹽水稀釋,吸取稀釋液小心加在淋巴細胞分離液上(兩者比例為2∶1)。室溫下離心20min,離心速度為1800～2000 r/min。小心吸取離心管中白膜層,轉移至潔凈離心管中,離心速度為1500 r/min,離心時間10 min。分離出單個核細胞后在體外擴增14 d后傳至第3代，沉淀物用30ml生理鹽水稀釋成適用濃度的干細胞懸液,取1μl稀釋后于顯微鏡下觀察形態和細胞計數為6×106/m l以備用。

1.5 自體骨髓間充質干細胞移植

在手術室嚴格無菌條件下操作,在硬膜外麻醉下，首先將患者右足底及足背皮膚缺損處常規清創后，將MSCs干細胞混懸液一次性注射在缺損創面,術后用無菌紗布及繃帶保護創面。

1.6 傷口恢復觀察

患者足部皮膚缺損部位的術前創面和術后恢復情況用數碼相機拍照記錄，同時觀察患者有無移植排異反應和手部炎癥腫脹情況。

1.7 HE染色

移植術后30個月，手術取右足局部已痊愈的皮膚組織，大小約0.5 cm×0.2 cm，經4%多聚甲醛固定過夜。乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋。切片后二甲苯脫蠟透明，并重新水化。切片由蘇木素伊紅順次染色。封片并顯微觀察皮膚病理變化。

2 結果

2.1 癥狀和體征

移植后第3 d天開始，患者即感覺右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉,局部膿性分泌物明顯減少，局部腫脹開始減輕，局部缺血狀況也逐漸改善，缺損面逐漸縮小。

2.2 感染傷口愈合情況

第一次移植術后第3 d觀察發現，右足底皮膚缺損傷口處膿性分泌物開始減少，腫脹有所減輕（見圖1，B），第9d后傷口大小由原來的10.0cm×15.0cm逐漸縮小成9.0 cm×13.0 cm，局部缺血狀況也逐漸改善；第二次移植術后第3 d觀察發現，局部傷口膿性分泌物明顯減少，腫脹減輕，傷口大小縮小成7.0 cm×11.0 cm（見圖1，C），第7 d局部傷口表面無膿性分泌物滲出，可見新生肉芽組織形成，傷口縮小成7.0 cm×10.0 cm（見圖1，D），第二次移植術后第36 d，傷口痊愈（見圖1，E）。

圖1 右足自體骨髓干細胞移植術前后傷口愈合情況

2.3 相關并發癥

患者骨髓干細胞移植后骨髓穿刺點傷口很快愈合，無異常癥狀或體征出現;血、小便、大便三大常規及肝、腎功能等生化檢查均未見異常。

2.4 組織學觀察新生皮膚

該患者30個月后再次來我院門診隨訪復查發現，接受骨髓干細胞移植的右足局部情況穩定,無移植相關的免疫排斥等并發癥的發生（見圖1，F）。同時手術切取了已愈合傷口的局部全層皮膚組織一塊，大小為0.5 cm×0.2 cm，并行病理切片HE染色檢查。結果發現，表皮輕度增生伴角化過度，局灶區基底細胞色素增加，真皮淺層膠原纖維增生、變性和小血管周圍少量淋巴細胞浸潤。但與正常皮膚組織在病理上無顯著差異，且無腫瘤跡象（見圖2）。

圖2 右足干細胞移植術后痊愈皮膚局部病理切片（術后30個月）

3 討論

大量的動物實驗證實，利用MSCs作為種子細胞構建組織工程皮膚對皮膚缺損具有顯著促愈作用,創面經修復后具有全層皮膚結構[8-10]。方利君等[11]通過動物實驗的研究，發現創面愈合過程中,MSCs與肉芽組織中小血管的形成密切相關。因此在創面微環境下,MSCs可分化為血管內皮細胞,并參與皮膚缺損創面的修復。研究表明,MSCs可分化成血管內皮細胞并應用于治療缺血性疾病[12-15]。Rathnavelpandian S等[16]等利用單個核細胞治療了6例糖尿病嚴重肢體缺血及皮膚缺損，臨床效果顯著，接受自體干細胞移植的患者全部避免了截肢。

本例系一例糖尿病患者車禍后右足毀損傷致傷口嚴重感染伴皮膚重度缺損，傷口局部出現明顯血運不良及頑固性傷口不愈合等，入院后經常規胰島素泵強化治療、抗感染及傷口局部清創換藥等綜合治療64 d余，病情未見好轉，但采用自體MSCs移植治療72 h后患者即感覺右足疼痛、冷感和麻木感開始好轉,局部腫脹也開始消退,感染傷口膿性分泌物明顯減少，傷口面積逐漸縮小，直至完全愈合，臨床療效較顯著，并且避免了截肢。但由于目前有不少學者質疑[17-19]，MSCs移植到體內會不會使得細胞產生多種形式的基因突變，會不會如腫瘤細胞一樣無限增殖和生長，甚至引發腫瘤的形成等安全性方面的擔憂。然而，據專家們預測人類誘導多能干細胞（human induced pluripotentstem cells，IPSC）其潛在的致瘤性等于或高于胚胎干細胞。因此，基于以上種種對干細胞成瘤性的擔憂，我們針對該患者進行了進一步的隨訪觀察和臨床研究。在患者出院30個月后，再次聯系到我院門診隨訪復查，結果發現接受自體MSCs移植的右足已痊愈的傷口局部情況穩定（見圖1，F）,無移植常見的免疫排斥等并發癥的發生，同時取已愈合傷口的局部行全層皮膚組織病理切片檢查發現，與正常皮膚組織在病理上無明顯差異，且無腫瘤的形成（見圖2）。因此，在臨床采用自體MSCs體外擴增移植療法可能成為一種簡便、有效的治療嚴重皮膚缺損的新手段、新策略,同時也可以解決創傷后皮膚重度缺損傷口的嚴重感染及局部血運不佳等問題，且無移植相關排斥反應及腫瘤形成等,從而達到治療的目的。另外，本研究還可以為在臨床上應用自體MSCs移植技術治療各種外傷所致皮膚缺損提供一條新的治療路徑。

我們認為,今后在臨床上開展自體MSCs移植治療各種外傷所致皮膚缺損的臨床試驗的方法學還有待于提高，應當進行高質量的多中心、隨機、雙盲對照試驗，以進一步證實這種新的治療方法的臨床療效。目前MSCs的分化機制和誘導條件及其治療皮膚缺損確切的機制方面尚不清楚，但推測其可能的機制[11]為，在創面微環境中MSCs可分化為血管內皮細胞而參與創面修復,促進新生血管的形成，此外，MSCs在移植局部被誘導分化為內皮細胞,并在局部釋放多種細胞因子以及信號的傳導等相關問題，都還有待于我們通過動物實驗及基礎研究得到進一步的證實。此外，對自體MSCs移植相關的免疫排異反應、成瘤性及遠期療效等方面做進一步更加嚴密的科學觀察和臨床研究還是很有必要的。

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（2013-12-02收稿）

Bone-m arrow stem cellautotransp lantation treating one caseof footdestructive injuryw ith severeskin defect

Liu Yihong，Wang Pujie，Tian Haoming1，Zhou Yi,Deng Yong2
Diabetic Centre of Control and Prevention，the PLA 520 Hospital；1Department of Endocrinology and Metabolism,WestChina Hospitalof Sichuan University；2DepartmentofUrological Surgery，the Affiliated Hospitalof LuzhouMedicalCollege

Objective：Toevaluate thecurativeeffectof autotransplantation ofmesenchymalstem cells(MSCs)on foot destructive injury with infection and severe skin defectand to observe if there were rejection and tumorigenic change.Methods：A patientwith foot destructive injury，and a ten-year history of type 2 diabetes,after in effective routine therapy and twice skin grafting was treated with MSCs autotransplantation.MSCs were harvested from the patient'sbonemarrow.The autologousMSC suspensionwas twice injected into the skin defectof foot after theblood glucose levelbeing stabilized.The patientwas followed up.Results：36 daysafter the second autotransplantation,the skin defect healed.During 34 month postoperative follow-up,the patient showed immediate recovery with no transplant-related complications,or tumorigenic changes.Conclusion:The transplantation of autologous MSCs is effective in the clinical treatmentofskin defecteitherafter surgery ofdiabetic patientsor resulted from other various traumas.

Stem cells；Autotransplantation；Destructive injuryof foot；Skin defect；Tumorigenic change

R658

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.017

劉儀紅(1970-)，女，主任醫師，E-mail:lyh9504@126.com