湘產百合核心種質庫的SRAP體系的建立

高 昱，易剛強，劉平安，鄒君華，蔡嘉洛，張亞利，童巧珍*（.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 4008；.平江縣南江學區石漿中學，湖南 岳陽 40400）

·中藥化學·

湘產百合核心種質庫的SRAP體系的建立

高 昱1，易剛強1，劉平安1，鄒君華2，蔡嘉洛1，張亞利1，童巧珍1*
（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.平江縣南江學區石漿中學，湖南 岳陽 410400）

目的 確立適用于湘產百合核心種質庫的相關序列擴增多態性（SRAP）反應體系。方法 根據構建核心種質庫的需求，對實驗步驟、評分規則進行針對性改良，通過Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶、模板5因素4水平的正交試驗與單因素試驗構建SRAP體系，并篩選出適用引物。結果 最佳反應體系 （20 μL）：Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度0.20 μmol/L，引物濃度0.20 μmol/L，Taq酶1.0 U，模板DNA 50 ng能獲得明亮清晰的擴增條帶；并由144對引物組合中篩選出32對產物穩定、多態性豐富的引物組合。結論 該體系具有較高的穩定性，并可提高引物使用率，滿足百合核心種質構建對大信息量的需求，適用于湘產百合核心種質庫的研究。

百合；核心種質；相關序列擴增多態性；體系優化

百合來源于單子葉植物亞綱百合科（Liliaccae）百合屬（Lilium）植物:卷丹（Liliwn lancifolium Thunb）、百合（L.brownii var.viridulum Baker）、細葉百合（L.pumilum DC）的干燥肉質鱗葉，含有酚酸甘油酯、苷類、生物堿、多糖等活性成分[1]，其現代藥理學研究表明百合具有抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、免疫調節、鎮靜及抗應激損傷等多種作用[2-4]，集藥用、食用和觀賞為一體。湖南為我國百合主要產區之一，更是擁有龍牙百合、龍山百合資源地理標志權的特色優勢[5]。

核心種質庫能以最少的重復代表一個種及野生近緣種的最大范圍的遺傳多樣性，能夠提高種質資源的利用率；但構建過程需要豐富的樣品子集信息，且需要對子集信息進行及時更新，對信息獲得和處理有著較高的要求[6-7]。相關序列擴增多態性分子標記（SRAP）結合了AFLP及RAPD各自的優點，具有高效性、引物通用、不需預先知道DNA序列信息，共顯性率高，可快速獲得大量信息[8]，符合核心種質構建的需求。現今，湖南百合種質資源遭到破壞和不合理開發的現況，為保護百合種質和指導合理開發研究，因此有必要建立用于構建湘產百合核心種質庫的SRAP體系，為進一步構建核心種質提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以隆回縣荷香橋鎮產百合種質為模板供體系優化及引物篩選試驗，采用湖南其它地區（衡山縣、瀏陽縣、平江縣、龍山縣及懷化、益陽等地）百合種質進行通用性驗證。

1.2 儀器與試劑

MGL96G型PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；GIS-1000B型凝膠成像系統 （上海天能科技有限公司）。dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000均購自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；參考Li[9]引物設計原則由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與SRAP-PCR擴增程序 取新鮮百合鱗莖，采用改良 CTAB法[10-12]提取百合種質DNA，調整DNA濃度至100 ng/μL，-20℃保存。對百合種質DNA進行PCR擴增，擴增程序為: 94℃預變性5 min，94℃變性1 min，37℃復性1 min，72℃延伸 2 min，5個循環，94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸2 min，35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存，擴增產物經1.5%瓊脂糖電泳分離（0.5×TBE，80 V，100 min），凝膠成像系統觀察。

1.3.2 SRAP體系確立與優化 試驗采用20 μL體系，以組合 Me1 Em12（見表 1）為擴增引物，使用 L16(45)正交表對 dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物、模板 DNA濃度五因素四水平（見表2）進行正交優化，重復3次，并使用 2種不同質量DNA進行驗證試驗各1次，驗證不同質量DNA對體系影響。在正交實驗篩選出的最佳組合基礎上，設置單因素梯度濃度（見表3）進行單因素優化，試驗結果結合正交試驗直觀分析，獲得優化體系。

隨著我國教育事業的不斷發展，教學模式也越來越多樣化，在對人才的教育教學過程中教師應該不僅僅是進行課堂教學，通過利用數字媒體技術來提高學生的學習經驗和個人素質素養。對于每個人一生的教育學習來說，專業核心能力的教育培養非常重要。加強人才培養過程中的數字媒體技術的運用，堅持社會主義教學事業的快速發展，推動科學的教育事業發展，做好對孩子德智體美的全面發展工作，做好人才的前期的培養工作，為中國未來的發展奠定有利的教育基礎。

參考王騫春[13]所用評分規則并做適當修改，對3次正交試驗擴增結果進行評分；具體規則依擴增條帶的敏感性與多態性將擴增結果分為4個等級，即無條帶記0分，多態性條帶最多記2分，中間等級依條帶情況記1分、1.5分；條帶清晰記1分；條帶亮度過亮或過暗記-0.5分；3次正交試驗均有條帶額外加記1分，3次試驗得分累加得總分。各組評分結果見表2。

1.3.3 引物篩選與退火溫度篩選 144對（見表1）上游、下游引物組合使用模板DNA在確立的優化體系中進行擴增，對擴增結果進行第1次篩選；對擴增效果不理想的引物組合，相同體系中進行擴增、補充篩選。對反應程序中第1步退火溫度以37℃為中心溫度、±5℃梯度范圍設置12個溫度梯度，對兩次篩選合格的引物組合在優化體系進行退火溫度篩選。

1.3.4 反應體系驗證 隨機選取2對已篩選出的引物組合，在優化體系中使用其最佳退火溫度，對湖南其他地區的百合種質進行PCR擴增，驗證反應體系通用性及穩定性。

表1 SRAP引物序列

表2 SRAP-PCR體系L16(45)正交試驗

表3 SRAP-PCR單因素試驗因素水平及各水平均數

2 結果與分析

2.1 正交試驗分析

2.1.1 正交試驗直觀分析 據評分規則獲得的實驗結果總分進行直觀分析，在實驗范圍內，直觀分析優選的最佳組合為:Mg2+濃度3.0 mmol/L，dNTPs濃度0.20 μmol/L，引物濃度0.20 μmol/L，Taq酶1.0 U，模板DNA 50 ng；通過R值對比，各因素對反應體系影響從大到小依次為:Mg2+＞引物＞dNTPs＞模板 DNA＞Taq酶濃度；dNTPs濃度 0.20～0.25 μmol/L直觀分析的k值（見表2）相同，表明此濃度內對試驗結果無明顯影響；直觀分析獲得的體系最佳Mg2+濃度3.0 mmol/L的k值最高，但與最高得分組合3的Mg2+濃度2.5 mmol/L存在差異，直觀分析結果與試驗結果不符；引物濃度、Taq酶與模板DNA用量的直觀分析結果與最高得分組合匹配。

2.1.2 正交試驗方差分析 利用SPSS 17.0軟件對3次正交重復試驗的得分結果進行方差分析 （見表4）；重復試驗P＞0.05，可認為3次重復試驗間無差異；dNTPs、Mg2+、引物的P值都為0.000，有統計學意義，為試驗的主要影響因素，Taq酶、模板DNA的P＞0.05，無統計學意義，表明對試驗結果產生的影響不顯著，為次要因素，Taq酶、模板DNA用量在試驗范圍內均可。根據表3，對比各因素水平均數（試驗結果評分越大越好），方差分析與直觀分析所獲得的最佳組合相同。

根據數據的直觀分析與方差分析，Mg2+濃度為體系中主要影響因素，但是數據分析結果與試驗擴增結果所獲得的最佳水平存在差異，仍不能明確最佳水平；同時非主要因素的Taq酶、模板DNA的具體用量仍需明確；因此，參考邱帥等[14]方法，對反應體系進行單因素驗證，以說明水平間差異對體系的具體影響。

根據單因素試驗結果，最終確立 Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度 0.20 μmol/L，引物濃度0.20 μmol/L，Taq酶1.0 U，模板DNA 50 ng。各單因素梯度變化的SRAP-PCR電泳結果，見圖1。

2.2.1 Mg2+濃度梯度

表4 SRAP-PCR正交試驗方差分析

圖1 dNTPs、Mg2+、模板DNA梯度變化的SRAP-PCR電泳圖

Mg2+濃度對體系影響有多個方面，游離Mg2+是Taq聚合酶的激活劑，同時影響退火溫度，對PCR反應的特異性和擴增效率均有明顯影響[15]。Mg2+濃度在1.5 mmol/L無條帶，2.0～3.0 mmol/L濃度范圍均出現可辨識條帶。條帶在2.0 mmol/L濃度梯度背景過于明亮，且條帶界限不清晰；Mg2+濃度在3.0 mmol/L濃度梯度，比較其他梯度的條帶在1000 bp左右位置出現一條模糊的雜帶；印證直觀分析Mg2+因素k3、k4（見表3）值與k1、k2值存在較大差距結論，且k3、k4值差距較小。根據單因素試驗結果，綜合考慮條帶界限與雜帶，確立2.5 mmol/L濃度梯度為體系最佳Mg2+濃度。

2.2.2 模板DNA濃度梯度 電泳條帶表明，30 ng模板DNA用量過低，未出現條帶，認為30 ng模板用量導致實驗穩定性不佳；40～60 ng均可出現清晰明亮條帶，但60 ng用量時出現雜帶和二聚體；40 ng與50 ng用量電泳條帶并未出現明顯差異；考慮實驗穩定性，并結合正交試驗分析模板DNA為次要因素的結論，確立50 ng模板用量為最佳體系模板DNA使用量。

2.2.3 Taq DNA聚合酶 與方差分析結論相同，不同Taq酶用量，電泳結果未出現用量過低導致擴增結果條帶少及用量過高導致的背景過亮現象；在用量1.25 U時出現雜帶，認為體系0.5~1.00 U用量可出現明亮清晰條帶；根據正交試驗的擴增結果，為保證體系穩定可靠，選擇1.00 U為最佳Taq DNA聚合酶用量。

2.3 引物篩選結果與退火溫度確立

144對上游、下游引物組合中，共篩選出32對（見表5）產物穩定、多態性豐富的引物組合。部分引物篩選電泳結果，見圖2。

圖2 部分引物篩選電泳圖

退火溫度過低，影響擴增特異性；退火溫度過高，則引物與模板不易結合。對反應程序中第一步退火溫度設立31.9、32.6、33.4、34.2、35.3、36.3、37.5、38.6、39.8、40.7、41.6、42.1℃共12個梯度，試驗退火溫度對引物特異性影響。引物組合Me7 Em11（見圖3）在低于退火溫度34.2℃時，條帶缺失或過暗，高于35.3℃可獲得清晰條帶；在高于39.8℃時，較小堿基對單位條帶減少，較大堿基對單位條帶增多；在36.3℃（泳道6）時條帶豐富且明亮清晰、條帶界限清楚，確定36.3℃為引物組合Me7 Em11最佳退火溫度。引物組合最佳退火溫度見表5。

圖3 引物組合Me7 Em11退火溫度梯度電泳圖

2.4 通用性驗證

隨機選取2組篩選出引物在優化體系中，對湖南其他地區（見1.1）的百合種質進行擴增。實驗結果顯示電泳條帶清晰明亮，多態性豐富，不同來源百合種質DNA擴增條帶具有明顯差異（見圖4-5），表明優化后體系適于湘產百合核心種質庫的構建及遺傳多樣性檢驗。

表5 已篩選引物組合最佳退火溫度

3 討論

構建核心種質庫時通過對樣品子集篩選出最優地代表特定遺傳多樣性的資源子集，這需要子集涵括豐富且精確的遺傳信息。本研究對試驗步驟進行調整，根據SRAP引物通用性好的特點，選取智麗等[16]研究中可靠性、通用性理想的引物組合，先進行正交試驗確立反應體系，再進行引物篩選及退火溫度篩選。步驟調整表現為幾個方面的優勢:（1）對前人研究肯定并驗證，選取擴增產物多態性表達理想且重現性、重復性好的引物組合，確保正交試驗穩定可靠；（2）減免了PCR反應體系不佳影響條帶顯示效果等原因導致的引物漏篩現象，從而提高引物利用效率；（3）為核心種質構建及遺傳關系分析提供更為豐富的樣本條帶，豐富子集信息，保證數據分析精確性。

圖4 引物組合Me7 Em11電泳圖

圖5 引物組合Me2 Em12電泳圖

反應體系中各種因素綜合影響SRAP擴增效果，其中SRAP-PCR反應體系對DNA質量有較高的要求，5次正交試驗采用同種不同批次模板，其中3次正交試驗使用模板OD260/280值均為1.82，2次正交驗證試驗使用模板OD260/280值分別為1.67、1.91；5次試驗均可擴增出條帶，結果整體趨勢相同，無明顯差異；試驗結果表明百合種質模板DNA OD260/280值在1.67~1.91范圍內可用于SRAP-PCR反應，對正交試驗過程及結果無顯著性影響，通過對供試材料進行有效的質量控制，保證優化體系的可靠性，適應性。

正交試驗與單因素實驗結合，不僅能夠很好地反映各因素間的相互影響，又能有效地表明各水平間對體系影響的差異，通過評價原則的改進，增加試驗重現性效果的分值，實現對多態性擴增效果評分的細化，整合條帶清晰效果評分，得以降低直觀分析的主觀性影響。試驗結果表明Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶、模板五種因素均對條帶多態性，亮度，清晰程度有直接影響，優化后的SRAP反應體系具有較好的穩定性、重現性與適應性，擴增產物多態性好，信息量豐富，引物利用率高，可用于湘產百合核心種質的研究。

[1]曲偉紅，周日寶，童巧珍，等.百合的化學成分研究概況[J].湖南中醫藥導報，2004，10(3):75-76.

[2]曾 嶸，李福元，龍洛娜.3種百合水煎液抗疲勞與耐低氧作用比較[J].醫藥導報，2007，26(8):850-851.

[3]黃燕萍.百合的研究現狀[J].中國藥業，2010，19(8):88-90.

[4]彭蘊茹，錢大瑋，丁永芳，等.百合不同提取部位的藥理活性比較[J].現代中藥研究與實踐，2006，20(1):31-32.

[5]胡 再，孫志國，黃莉敏，等.百合資源地理標志權與植物新品種權保護[J].安徽農業科學，2012，40(16):8 997-8 999.

[6]聶 瓊，劉仁祥，梁 微.用ISSR標記構建煙草核心種質的指紋圖譜[J].西南農業學報，2010（2）:332-339.

[7]邱麗娟，李英慧，關榮霞，等.大豆核心種質和微核心種質的構建、驗證與研究進展[J].作物學報，2009（4）:571-579.

[8]任 羽，王得元，張銀東.辣椒SRAP-PCR反應體系的建立與優化[J].分子植物育種，2004，2(5):689-693.

[9]LiG,QuirosCF.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in brassica[J]. Theor Appl Genet，2001(103):455-461.

[10]陳昆松，李 方，徐昌杰，等.改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J].遺傳，2004，26(4):529-531.

[11]陳名紅，李 玉，劉 多，等.百合屬ISSR反應條件優化的研究[J].中國農學通報，2013，29(4):118-122.

[12]黃永芳，楊懋勛，柳 軍，等.廣東野百合DNA提取和RAPD條件的優化[J].熱帶亞熱帶植物學報，2006，14(3):251-255.

[13]王騫春，黃 夏，李光森.小干松SRAP-PCR反應體系的建立[J].北方園藝，2013(2):83-86.

[14]邱 帥，丁信譽，席夢利，等.東方百合SRAP體系優化及引物篩選[J].南京林業大學學報(自然科學版)，2013，37(3):6-10.

[15]徐建華，楊虹琦，楊 程，等.煙草DNA的提取與SRAP反應體系優化[J].湖南農業大學學報(自然科學版)，2009，35(3):257-259.

[16]智 麗，藤中華，李先源，等.通江百合SRAP-PCR體系優化及引物篩選[J].西南大學學報(自然科學版)，2013，35(4):32-38.

（本文編輯 楊 瑛）

SRAP-PCR System Optimization for Core Collection Establishment of Lily in Hunan

GAO Yu1,YI Gangqiang1,LIU Pingan1,ZOU Junhua2,CAI Jialuo1,ZHANG Yali1,TONG Qiaozhen1*
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.Shijiang Middle School of Nanjiang District,Yueyang,Hunan 410400,China)

ObjectiveThe SRAP system of lily from Hunan province for core collection was established.MethodsAccording to the requirements of building core collection,the experimental procedures and scoring rules were modified.The SRAP system was established through the single factor test and orthogonal design at four levels and five factors:Mg2+,dNTPs,DNA template,primers and DNA polymerase,and the optimized primers were screened.ResultsThe best reaction system was 20 μL reaction solution,containing 2.5 mmol/L Mg2+,0.20 μmol/L dNTPs,0.20 μmol/L primers, 1.0 U DNA polymerase,50 ng DNA template.This system showed bright and clear amplified bands. 32 primers with rich polymorphism and steady bands were selected from 144 primers.ConclusionThis system with high stability could improve the utilization rate of primer and meet the large information for the core collection establishment.The system is applicable to establish the core collection of lily from Hunan province.

lily;core collection;SRAP;system optimization

R282.71；Q949.71+8.2

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2014.12.004.013.06

2014－08－23

湖南省科技廳資助項目（2013RS4040）；湖南省中醫藥管理局資助項目（2012164）。

高 昱，男，在讀碩士研究生，主要從事中藥資源研究。

*童巧珍，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail:qztong88@126.com。