脾虛證慢傳輸型便秘小鼠模型構(gòu)建方法的比較研究

夏旭婷，樊俊陽，王碧玉，胡 政，喻長紅，李 霞，劉富林*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

慢傳輸型便秘(Slow transit constipation，STC)是常見的消化系統(tǒng)功能性疾病， 系結(jié)腸傳輸功能障礙，內(nèi)容物滯留于結(jié)腸或結(jié)腸通過緩慢引起的頑固性便秘。 因其發(fā)病機(jī)制不明，極大影響了臨床診療。辨證論治是中醫(yī)學(xué)的特點(diǎn)之一，病癥結(jié)合的脾虛證STC 小鼠模型是研究脾虛證STC 病理生理的基礎(chǔ)。目前STC 小鼠模型大多以鹽酸哌洛丁胺造模[1]，而脾虛證STC 小鼠模型主要采用番瀉葉+限水+控制飲食、游泳結(jié)合饑飽失常等復(fù)合因素造模。 本實驗從3 種不同的STC 小鼠模型中優(yōu)化脾虛證STC 模型的建立。 現(xiàn)將方法和結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和分組 SPF 級昆明小鼠80 只， 雄性，體質(zhì)量(29.0±1.8)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司， 實驗動物許可證號：SCXK (湘)2013-0004。 將小鼠分籠飼養(yǎng)，保持適宜的環(huán)境(室溫23～25 ℃，相對濕度50%～70%，清潔安靜)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分成4 組：正常組、模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組20 只（其中10 只做排便實驗，10 只做腸道推進(jìn)率和血清D-木糖含量檢測）。

1.1.2 藥物及試劑 番瀉葉（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：20140225）；鹽酸洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號：131120657）；印度墨水（北京諾博萊德科技有限公司）；D-木糖試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號：20140320）。

1.1.3 主要儀器 XSP-10C 生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；TG16-WS 臺式高速離心機(jī) （長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-1800 紫外可見分光光度計（長沙市八方科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 （1）番瀉葉浸泡液的制備 取番瀉葉500 g，加10 倍量沸水浸泡10 min，濾過，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮成濃度為l g/mL 的水煎液放入玻璃瓶中，編號、冷藏、備用。 （2）鹽酸洛哌丁胺混懸液的制備 將鹽酸洛哌丁胺膠囊以研缽研磨至極細(xì)粉末， 按成人1日最大量折算成小鼠的用量， 用蒸餾水調(diào)配成濃度為0.2 g/mL 的混懸液，編號、冷藏、備用。

1.2.2 模型制備 模型Ⅰ（番瀉葉組）[2]：第1 天～第7天，番瀉葉按20 g/（kg·d）計算，灌胃，正常飲食飲水，第8 天起停用番瀉葉，隔天喂生大米4～8 g，隔天飲水1 次，每次0.5 h，造模共15 d。模型Ⅱ（游泳組）[3]：隔天進(jìn)食普通飼料致饑飽失常，每天游泳2 次，每次10～20 min 致過度疲勞，連續(xù)12 d，從第13 d 開始禁水，以大米喂養(yǎng)3 d，造模共15 d。 模型Ⅲ（哌洛丁胺組）[4]： 連續(xù)7 d 按體質(zhì)量0.2 mL/10 g 灌鹽酸哌洛丁胺混懸液， 造模共7 d。 空白組小鼠按0.2 mL/10 g 灌蒸餾水。

1.3 評價方法

1.3.1 一般行為學(xué)特征 每天觀察并記錄小鼠的活動度、精神狀況、毛發(fā)光澤度及排便情況，每3 d稱體質(zhì)量1 次。

1.3.2 排便實驗觀察 每組隨機(jī)取10 只小鼠均禁食不禁水24 h，經(jīng)口灌入印度墨水0.2 mL/只，從灌胃完畢開始記時，記錄每只小鼠從灌胃到首粒黑便排出的時間，連續(xù)觀察6 h，記錄6 h 總排便粒數(shù)并稱質(zhì)量。

1.3.3 血清D-木糖含量檢測 每組剩余的10 只小鼠均禁食不禁水24 h。 按10 mL/(kg·d)劑量給予小鼠3% D-木糖溶液灌服， 麻醉l h 后眼球取血，血液靜置2 h 后，3 500 r/min 離心15 min 制備血清，按照D-木糖試劑盒說明書所述，應(yīng)用紫外可見分光光度計測定各組小鼠血清D-木糖含量。

1.3.4 腸道推進(jìn)率檢測 灌完D-木糖液的小鼠40 min 后經(jīng)口灌入印度墨汁0.2 mL，20 min 眼球取完血后立即剖腹取出幽門到直腸末段的全部腸道，生理鹽水沖洗后，無張力狀況下測量腸道全長及墨汁推進(jìn)長度，計算墨汁推進(jìn)長度占腸道全長的百分比(黑染腸管長度/腸管總長度×%)。

1.3.5 結(jié)腸黏膜病理檢測 取約2 cm 結(jié)腸組織放入4%甲醛液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成厚度為0.4 μm 組織切片，HE 染色， 在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)特征比較

正常組小鼠外觀豐滿，反應(yīng)靈敏，活動迅速，背毛濃密有光澤，飲食、飲水適中，大便成形，質(zhì)軟，量一般，體質(zhì)量增加。 造模成功后3 組小鼠外觀干癟、瘦小、皮肉松弛，豎毛、毛質(zhì)粗糙色深，拱背、活動減少，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量減輕，糞便干結(jié)、質(zhì)硬，數(shù)量減少，顆粒細(xì)小。 模型Ⅲ較模型Ⅰ、Ⅱ組小鼠變化程度輕，體質(zhì)量先輕度下降，后又成增長趨勢。

2.2 各組小鼠排便情況比較

與正常組相比，3 種模型小鼠首粒黑便傳出時間均顯著延長(P＜0.01)； 且模型Ⅰ組顯著長于模型Ⅱ、Ⅲ組(P＜0.01) 。 6 h 排便數(shù)量和質(zhì)量模型Ⅰ、Ⅲ組均較正常組減少(P＜0.05 或P＜0.01)；與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ、Ⅲ組差異顯著(P＜0.05 或P＜0.01)；而模型Ⅱ組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。 結(jié)果見表1。

2.3 各組小鼠腸道推進(jìn)率及血清D-木糖含量檢測比較

與正常組相比，各模型組小鼠腸道推進(jìn)率都有降低的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；血清D-木糖含量模型Ⅰ、 Ⅱ組與正常組相比顯著降低（P＜0.01）， 模型Ⅰ與模型Ⅱ組間比較無差異 (P＞0.05)，但均低于模型Ⅲ組（P＜0.01）。 結(jié)果見表2。

表1 各組小鼠排便情況比較 （±s，n=10）

表1 各組小鼠排便情況比較 （±s，n=10）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型Ⅰ比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型Ⅲ比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。 下表同。

組 別正常組模型Ⅰ模型Ⅱ模型Ⅲ首粒黑便排出時間（min）134.00±34.62 331.25±23.41**218.13±26.31**△△▲281.25±40.86**△△6 h 排便數(shù)量（粒）15.30±1.34 2.00±1.00**13.89±1.27△△▲▲4.78±1.00**△△6 h 排便質(zhì)量（g）0.56±0.24 0.02±0.12**0.52±0.12△△▲0.48±0.16*△

表2 各組小鼠腸道推進(jìn)率及血清D-木糖含量比較（±s，n=10）

表2 各組小鼠腸道推進(jìn)率及血清D-木糖含量比較（±s，n=10）

組 別正常組模型Ⅰ模型Ⅱ模型Ⅲ腸道推進(jìn)率（%） 血清D-木糖（mmol/L）78.27±7.09 0.43±0.12 71.56±8.97 0.14±0.09**▲▲76.64±7.18 0.20±0.06**▲▲73.93±8.98 0.42±0.05

2.4 結(jié)腸黏膜病理檢測

正常組小鼠結(jié)腸黏膜未發(fā)現(xiàn)黏膜層、肌層及肌間神經(jīng)叢的病變；模型Ⅰ組小鼠可見輕度結(jié)腸黏膜炎癥改變，整個肌層包括平滑肌細(xì)胞及肌間叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等未見明顯細(xì)胞變性及壞死；模型Ⅱ組小鼠結(jié)腸黏膜未發(fā)現(xiàn)黏膜層、 肌層及肌間神經(jīng)叢的病變；模型Ⅲ組結(jié)腸黏膜呈輕度炎癥改變。 結(jié)果見封三彩圖圖1 所示。

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及精神心理因素的影響，便秘的患病率日益增加，且有隨年齡增長而升高的趨勢，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量[5]。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾主運(yùn)化，為氣血生化之源，若脾胃受損，氣血生成不足、運(yùn)行不暢，氣機(jī)阻滯，影響飲食物的消化吸收及糞便的形成、傳輸，故脾虛證是STC 常見的中醫(yī)證型[6]。 西晉《脈經(jīng)》卷二有“脾虛，……病苦泄注，腹?jié)M，氣逆。 ”明·繆希雍《本草經(jīng)疏》論述“脾虛十二證，飲食勞倦，傷脾發(fā)熱”，可見久泄、飲食不節(jié)、勞倦過度均可致脾虛，因此，本實驗選取的模型Ⅰ與模型Ⅱ以 “久泄致虛”“疲勞致虛”及“飲食不節(jié)損傷脾胃”的中醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)，建立脾虛型STC 模型。 其中，模型Ⅰ用番瀉葉+限水法+控制飲食造模， 既符合便秘患者服用瀉劑的病理過程，又可因控制飲食減慢腸道蠕動。 模型Ⅱ采用游泳結(jié)合饑飽失常法造模， 因游泳致疲致虛，饑飽失常致腸道運(yùn)動失司， 影響糞便的形成和傳輸，水的攝入減少又可使腸道蠕動減慢。 模型Ⅲ為以鹽酸洛哌丁胺混懸液造模，洛哌丁胺為阿托品受體激動劑，能激動腸壁阿片受體，阻止乙酰膽堿和前列腺素釋放，拮抗平滑肌收縮，減少腸蠕動和分泌。 本實驗所選取的3個模型都具有理論及實踐依據(jù)。

該實驗通過比較發(fā)現(xiàn)3 種模型小鼠糞便干硬，數(shù)量減少，顆粒細(xì)小，首粒黑便排出時間顯著延長。其中，模型Ⅰ、Ⅲ組小鼠6 h 排便數(shù)量和質(zhì)量減少，而模型Ⅱ組與正常組比較差異不明顯，可能是游泳在造成脾虛的同時，使腸道蠕動加快，再者，雖然結(jié)合饑飽失常及限水法， 小鼠在造模期排便減少，但在禁食不禁水的檢測過程中，因水的刺激導(dǎo)致小鼠腸道刺激性蠕動加快，排便短暫性增多。 模型Ⅰ、Ⅲ組小鼠表現(xiàn)為便秘，尤其以模型Ⅰ組小鼠便秘程度為重，其腸道傳輸功能明顯減弱。 血清D-木糖含量是反映消化吸收功能較為敏感和特異的檢測指標(biāo)，現(xiàn)已是驗證脾虛的經(jīng)典指標(biāo)[7]。 模型Ⅰ、Ⅱ組小鼠血清D-木糖含量顯著降低，外觀干癟、瘦小、豎毛、拱背、活動減少，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量減輕，表明小腸吸收功能減弱，符合脾虛的表現(xiàn)。3 種模型小鼠結(jié)腸黏膜均符合功能性疾病的病理表現(xiàn)，模型Ⅰ、Ⅲ組結(jié)腸黏膜呈炎癥改變，研究[8]認(rèn)為是因為結(jié)腸蠕動減慢，大便在腸道存留時間延長，腸內(nèi)細(xì)菌繁殖并分解產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)如吲哚酚類色氨酸代謝產(chǎn)物等致結(jié)腸黏膜腸神經(jīng)系統(tǒng)損害。

值得一提的是本實驗3 種模型小鼠腸道推進(jìn)率都有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 這與以往的文獻(xiàn)報道有差別。 究其原因，可能是墨汁在胃腸道的傳輸過程是經(jīng)過胃、小腸后才到結(jié)腸，胃及小腸對墨汁運(yùn)行速度影響較大， 而STC 病位在結(jié)腸，若胃排空或小腸蠕動加快，即使結(jié)腸蠕動減慢，仍會造成腸道推進(jìn)率下降不明顯甚至加快的結(jié)果。因此，腸道推進(jìn)率無法完全反映出結(jié)腸“慢傳輸”的特點(diǎn)。

綜上分析，模型Ⅰ（番瀉葉+限水法+控制飲食模型）值得作為研究脾虛證STC 的動物模型。 因其具有腸道傳輸明顯減慢、排便量減少、排便難、糞質(zhì)干硬的特點(diǎn)，與便秘臨床癥狀相似，首粒黑便傳出時間明顯延長、6 h 排便數(shù)量和糞便質(zhì)量明顯減少、血清D-木糖值顯著降低、 結(jié)腸黏膜無器質(zhì)性病變，更符合臨床上脾虛型慢傳輸型便秘的客觀標(biāo)準(zhǔn)。 通過本研究，認(rèn)為脾虛證STC 小鼠模型的評價指標(biāo)可包括：（1）動物的體征、行為表現(xiàn)，如外觀、精神狀態(tài)、體質(zhì)量及糞便的數(shù)量、質(zhì)地、顆粒大小等；（2）與證候相關(guān)的理化指標(biāo)，如D-木糖代謝率等；（3）與臨床相似的檢查指標(biāo)，如首粒黑便傳出時間、6 h 排便數(shù)量和質(zhì)量等；（4）組織病理學(xué)檢測，用以排除器質(zhì)性病變；（5） 從中醫(yī)病因?qū)W角度推測并認(rèn)定證候?qū)傩裕纭捌谥绿摗薄ⅰ熬眯怪绿摗保唬?）以方測證，治療性診斷，選擇臨床上療效確切的治療特定證候的經(jīng)典方劑及藥物分析對模型動物的影響，佐證證候?qū)傩浴?/p>

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