RP-HPLC法測定康普瑞丁A4磷酸酯聚合物囊泡的含量

朱金芳，胡夢瑩，邱利焱#（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 83005；.浙江大學藥學院，杭州 310058）

從南非灌木Combretum caffrum中分離得到的康普瑞丁A4（CA4）是一種作用于秋水仙堿位點的微管蛋白結合劑，康普瑞丁A4磷酸酯（CA4P）是CA4的水溶性的磷酸酯化前體藥物，是第1個低于最大耐受量（MTD）就可以選擇性地產生抗腫瘤血管作用的小分子血管破壞藥物[1]。CA4P不僅可特異性作用于腫瘤血管系統而不影響正常組織，快速破壞實體腫瘤血管，阻斷腫瘤血液供應，而且具有抑制癌細胞增長及放化療增敏的作用[2]，該藥在國外已進入Ⅲ期臨床研究階段。CA4P注射劑對光和熱不穩定，在動物體內半衰期短，在體內消除很快[3-4]。鑒于此，筆者將其包封于生物可降解的高分子聚合物囊泡中，增加了藥物的穩定性，使CA4P緩慢持續釋放，延長其在體內的作用時間，減少給藥頻率；并能通過納米囊泡的腫瘤組織增強滲透滯留作用（EPR effect）使CA4P被動靶向于腫瘤組織，從而提高療效、降低毒副作用。本文采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定CA4P聚合物/囊泡中CA4P的含量，系統地考察了方法的準確度、精密度及穩定性等，以期為CA4P聚合物/囊泡的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

AL104精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；1100 HPLC儀（美國Agilent公司）；TU-1800PC/SPC紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 藥品與試劑

CA4P對照品（四川大學提供，批號:20110310，純度:99.6%）；CA4P聚合物/囊泡（浙江大學藥學院藥物制劑研究所，批號:20120718、20120719、20120720，含量:含CA4P 190 μg/ml）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（10∶40∶50，pH為6.6），流速:1.0 ml/min；檢測波長:288 nm；進樣量:20 μl。

2.2 溶液的制備

對照品貯備液:精密稱取CA4P對照品適量，用流動相配制成含CA4P 210 μg/ml的溶液，搖勻即得。

對照品溶液:精密量取CA4P對照品貯備液適量，用流動相稀釋成含CA4P 10.5 μg/ml的溶液，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

供試品溶液:精密量取CA4P聚合物/囊泡溶液400 μl置于5 ml棕色量瓶中，用1 ml乙腈破壞囊泡，使藥物從囊泡中釋放出來，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

陰性對照溶液:取不加CA4P的空白囊泡溶液400 μl置于5 ml棕色量瓶中，用1 ml乙腈破壞囊泡，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 檢測波長的選擇

取上述對照品溶液，在600～190 nm波長范圍內進行波長掃描，確定最大吸收波長。結果顯示，對照品溶液在288 nm波長處左右有最大吸收，故選定288 nm為測定波長。

2.4 系統適用性試驗

在“2.1”項色譜條件下，取空白溶液（溶劑）、陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液（批號:20120718）進樣，結果顯示，理論板數按CA4P峰計算＞3000，供試品中CA4P峰與相近峰分離清晰完全，分離度＞1.5，空白和陰性對照溶液對CA4P主峰未見干擾，見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖A.空白；B.陰性對照；C.對照品；D.供試品；1.CA4PFig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.blank；B.negative control；C.reference substance；D.test sample；1.CA4P

2.5 線性關系考察

精密量取CA4P對照品貯備液（210 μg/ml）100、200、500 μl及1、2 ml，分別置于10 ml棕色量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾。分別精密吸取續濾液20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖。以CA4P的峰面積（y）為縱坐標、CA4P的質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝29.651x－9.6083（r＝0.9999）。結果表明，CA4P檢測質量濃度線性范圍為2.1～42 μg/ml。

2.6 檢測限與定量限試驗

以CA4P的色譜峰信噪比為3時的質量濃度為檢測限，信噪比為10時的質量濃度為定量限。取標準曲線最低質量濃度（2.10 μg/ml）對照品溶液稀釋10倍后進樣檢測，其信噪比＞3，因此檢測限定為0.21 μg/ml；稀釋3倍后進樣檢測，其信噪比＞10，因此定量限定為0.70 μg/ml，結果見圖2。

2.7 精密度試驗

取CA4P對照品溶液，分別注入色譜儀測定5次，記錄峰面積，計算其RSD＝1.53%（n＝5），表明該方法精密度良好。

2.8 重復性試驗

分別精密量取6份同一批號（20120718）CA4P囊泡400 μl，按供試品溶液的制備和測定法進行操作，測定CA4P含量，計算其RSD＝0.85%（n＝6），表明該方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

圖2 檢測限和定量限試驗高效液相色譜圖A.檢測限試驗；B.定量限試驗Fig 2 HPLC chromatograms of detection limit and quantification limit testsA.detection limit test；B.quantification limit test

分別精密量取200 μl同一批號（20120718）已知CA4P含量的CA4P囊泡9份，置于5 ml棕色量瓶中，分3組，分別加入高、中、低相應量的CA4P對照品貯備液，用1 ml乙腈破壞囊泡使藥物從囊泡中釋放出來，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，分別測定CA4P含量，計算回收率。結果平均回收率為96.72%，RSD＝1.61%（n＝3），表明該方法的準確度較好，詳見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.10 穩定性試驗

取供試品溶液分別于配制后0～8 h內，每2 h測定1次，結果含量的RSD＝1.75%（n＝5），表明供試品溶液在配制后8 h內穩定。

2.11 樣品含量測定

分別精密量取3批CA4P囊泡各3份，按供試品溶液處理方法制備供試品溶液，分別測定CA4P含量，結果見表2。

表2 3批樣品中CA4P含量測定結果（n＝3）Tab 2 Content determination results of CA4P in 3 batches of samples（n＝3）

3 討論

經掃描，CA4P在288 nm波長左右有最大吸收，與文獻[5]基本一致，故選擇288 nm為測定波長。與文獻中流動相條件為磷酸二氫鉀緩沖鹽相比[10]，本研究使用乙酸銨緩沖鹽能防止峰拖尾、改善峰形，且更有利于保護色譜柱。因CA4P對光和熱不穩定[6]，在囊泡制備及含量測定過程中應注意避光操作。由于CA4P被包封于生物可降解高分子聚合物囊泡中，要測定包載在聚合物囊泡內的CA4P的量，必須將囊泡破壞使藥物從囊泡中完全釋放出來。因制備囊泡所用的高分子聚合物材料能溶于乙腈中，故采用乙腈破壞囊泡。經重復性試驗及加樣回收率試驗證明，CA4P能夠完全從囊泡中釋放出來，方法的準確度及重復性均較好。

以上結果表明，RP-HPLC法測定聚合物囊泡中CA4P的含量，方法簡便、準確度、精密度、重復性、穩定性好，可有效控制聚合物囊泡中CA4P的含量。

[1]Dark GG，Hill SA，Prise VE，et al.Combretastatin A-4，an agent that displays potent and selective toxicity toward tumor vasculature[J].Cancer Research，1997，57（10）:1829.

[2]Prise VE，Honess DJ，Stratford MR，et al.The vascular response of tumor and normal tissues in the rat to the vascular targeting agent，combretastatin A-4-phosphate，at clinically relevant doses[J].Int J Oncol，2002，21（4）:717.

[3]張亮，孟志云，孫文種，等.高效液相色譜法測定獼猴血漿中的風車子素A-4及其磷酸酯[J].藥物分析雜志，2004，24（3）:270.

[4]劉靜，徐小平，張潔，等.綠原酸在兔體內對CA4P藥動學的影響[J].中國藥學雜志，2008，43（4）:297.

[5]尹佳，張亞蘭，莫毅，等.CA4P脂質體的制備工藝研究[J].華西藥學雜志，2009，24（6）:594.

[6]尹華熙，吳萍，徐小平，等.抗腫瘤新藥CA4P及其有關物質的IR結構解析[J].華西藥學雜志，2008，23（5）:523.