HPLC法檢查環戊丙酸雌二醇原料藥的有關物質

杜碧瑩（廣州市藥品檢驗所，廣州 510160）

環戊丙酸雌二醇為長效雌激素，其作用比戊酸雌二醇強而持久，維持時間在3～4周以上，臨床上主要用于卵巢功能不全、閉經、更年期綜合征、老年性陰道炎及前列腺癌等；其與甲羥孕酮組成復方注射用避孕藥（全球通用藥名Lunelle），可作為每月1次長效避孕劑，已獲美國FDA認可[1-2]。環戊丙酸雌二醇質量標準僅在《美國藥典》（USP）36版[3]有收載，2010年版《中國藥典》以及現行版《英國藥典》《歐洲藥典》《日本藥局方》均無收載。而目前USP 36版及國內研究并沒有對環戊丙酸雌二醇的有關物質進行定性定量研究，因此難以保證藥品質量。本文建立了新的有關物質檢查方法，并通過測定不同濃度雜質的標準曲線計算雜質校正因子，從而提高了有關物質控制的準確性，以更好地對環戊丙酸雌二醇的質量情況進行評價。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀系統、紫外檢測器、Chem Station工作站（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

環戊丙酸雌二醇（USP對照品，批號:CAT NO.1252003，純度:99.9%，105 ℃干燥4 h后用）；雜質Ⅰ[雌甾-1，3，5（10）-三烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環戊乙酸酯，企業工作對照品，批號:ZP034-S003，純度:99.28%）；雜質Ⅱ[雌甾-1，3，5（10），9（11）-四烯-3，17-二醇，（17β）-，17-環戊丙酸酯，企業工作對照品，批號:ZP034-S002，純度:98.58%）；環戊丙酸雌二醇原料藥（北京某公司，批號:20110941、20110942、20110943，純度:100.9%、99.9%、99.8%）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，25 cm×4.6 mm，5 μm）；流動相:硝酸銨溶液（取0.8 g硝酸銨，溶解于300 ml水中）-乙腈（23∶77，V/V），流速:1.5 ml/min；柱溫:35 ℃；檢測波長:280 nm；進樣量:50 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液。取環戊丙酸雌二醇原料藥適量，精密稱定，加溶劑[乙腈-水（70∶30）]溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 對照溶液。精密量取供試品溶液適量，加溶劑稀釋制成每1 ml中約含1 μg的溶液，即得。

2.2.3 對照品溶液。取雜質Ⅱ對照品適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含2 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取環戊丙酸雌二醇USP對照品、雜質Ⅰ與雜質Ⅱ對照品適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 ml中含1 mg、1.5 μg、2 μg的混合溶液。取50 μl，注入液相色譜儀，環戊丙酸雌二醇的保留時間約為20 min；環戊丙酸雌二醇峰與雜質Ⅱ的分離度應大于2.0，理論板數按環戊丙酸雌二醇峰計不低于5000。系統適用性溶液和供試品溶液（批號:20110941）色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.系統適用性溶液；B.供試品溶液；1.雜質Ⅰ；2.雜質Ⅱ；3.環戊丙酸雌二醇Fig 1 HPLC chromatogramsA.system suitability solution；B.test solution；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.estradiol cypionate

2.4 不同色譜柱試驗

比較了不同牌號的色譜柱對分析的影響，各指標結果見表1。

表1 不同色譜柱試驗結果Tab 1 Results of tests under different columns

試驗結果表明該流動相適用范圍較廣，選擇3種不同牌號的色譜柱均可適用，雜質Ⅱ與環戊丙酸雌二醇的分離度均大于2.0。

2.5 線性關系試驗

分別取環戊丙酸雌二醇、雜質Ⅰ與雜質Ⅱ對照品適量，用溶劑稀釋成質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml，0.3、0.6、0.9、1.5、2.0 μg/ml，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/ml的系列溶液進行測定，以峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x）為橫坐標，計算線性回歸方程，見表2。

表2 線性方程結果Tab 2 Linear equation

按最小二乘法以進樣量對響應值（峰面積等）進行線性回歸，求得兩條標準曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。雜質Ⅰ相對校正因子為0.970，雜質Ⅱ相對校正因子為0.368。

2.6 耐用性試驗

比較了不同流動相組成比例、pH、柱溫、流速、檢測波長等對測定結果的影響，見表3。

表3 耐用性試驗結果Tab 3 Results of durability test

結果顯示，雜質Ⅰ與雜質Ⅱ的相對保留時間比較穩定，雜質Ⅱ與環戊丙酸雌二醇的分離良好。計算得雜質Ⅰ的相對響應因子為0.9～1.0，雜質Ⅱ的相對響應因子為0.3～0.4，受參數變化影響較小。擬定標準雜質Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對照法計算，以相對主峰的保留時間進行定性；雜質Ⅱ采用雜質對照品外標法進行定量（與加校正因子主成分自身對照法計算的結果一致，見“2.11”項）。

2.7 精密度試驗

分別取“2.5”項下環戊丙酸雌二醇（1.0 μg/ml）、雜質Ⅱ（2.0 μg/ml）對照品溶液連續進樣6次，環戊丙酸雌二醇、雜質Ⅱ峰面積變化的RSD分別為0.1%、0.4%（n＝6）。

取供試品溶液（批號:20110941）連續進樣6次，峰面積的RSD為0.2%（n＝6）。

2.8 穩定性試驗

取供試品溶液（批號:20110941）放置0、8、16、24 h時取樣測定，峰面積的RSD為0.5%（n＝4）。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 雜質Ⅱ測定的準確度試驗

分別精密稱取環戊丙酸雌二醇原料藥（批號:20110941）9份，每份100 mg，置于100 ml量瓶中，精密加入雜質Ⅱ對照品貯備液（20 μg/ml）4、5、6 ml，加溶劑溶解并稀釋至刻度，測定高、中、低3種質量濃度的回收率，結果平均值分別為98.86%、99.92%、100.07%，總平均回收率為99.62%，RSD為0.6%（n＝9）。

2.10 雜質檢測限與定量限試驗

取“2.5”項下溶液適量，采用逐步稀釋法稀釋，當信噪比為3時，雜質Ⅰ、雜質Ⅱ與環戊丙酸雌二醇檢測限分別為6.3、1.5、2.3 ng；當信噪比為10時，雜質Ⅰ、雜質Ⅱ與環戊丙酸雌二醇定量限分別為21.0、5.0、7.7 ng。

2.11 樣品中有關物質測定結果

量取“2.2”項下供試品溶液、對照溶液、對照品溶液各50 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍，供試品溶液如有與雜質Ⅱ保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，不得過0.2%；在相對保留時間為0.7處如有雜質峰（雜質Ⅰ），不得大于對照溶液主峰峰面積的1.5倍（0.15%）；其他單個雜質不得大于對照溶液主峰峰面積（0.1%），雜質總量不得過1.0%。供試品溶液中任何小于對照溶液主峰面積0.1倍的峰可忽略不計。3批樣品有關物質檢查結果見表4。

表4 3批樣品有關物質檢查結果（%）Tab 4 Results of related substances in 3 batches of samples（%）

3 討論

（1）本試驗中取系統適用性試驗溶液進樣，用二極管陣列檢測器（DAD）檢測，環戊丙酸雌二醇、雜質Ⅰ及單個雜質的最大吸收波長為280 nm，雜質Ⅱ的最大吸收波長為263 nm。擬定標準采用280 nm作為檢測波長。由于雜質Ⅰ與雜質Ⅱ的相對保留時間重現性較好，雜質Ⅰ與雜質Ⅱ的相對響應因子受參數變化影響較小，故雜質Ⅰ按不加校正因子的主成分自身對照法計算，以相對主峰的保留時間進行定性。雜質Ⅱ采用加校正因子的主成分自身對照法與外標法計算的結果一致，由于雜質Ⅱ易于獲得，且經結構確證且純度大于98.5%，故擬定標準采用雜質對照品外標法進行定量。

（2）筆者曾采用梯度洗脫的方式進行有關物質檢查，由于不同的儀器間梯度準確度的差異會導致分離重現性差；而等度洗脫的方式重現性較好，各有關物質間的分離度均＞2.0，有關物質的定量準確度也不受影響，因此本試驗最終采用等度洗脫的方式。

（3）環戊丙酸雌二醇是以雌酚酮與環戊丙酰氯為起始原料，通過一系列酯化及水解后的終產物。環戊丙酰氯中含有微量環戊乙酰氯，與雌酚酮的反應副產物為雜質Ⅰ，雜質Ⅱ為雌酚酮脫氫物（雌酚酮及雌激素衍生物的合成中使用二氯二氰基苯醌脫氫[4]）與環戊丙酰氯的反應副產物。試驗發現3批樣品中均檢出雜質Ⅰ、雜質Ⅱ，但未檢出另一已知雜質雌二醇。

[1]雷貞武.新的激素避孕方法:Lunella注射避孕針[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2008，27（1）:58.

[2]唐彥，朱珠.月用避孕藥:復方甲羥孕酮[J].中國藥學雜志，2001，36（11）:285.

[3]The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopeia（36）-National Formulary（31）[S].Baltimore:United Book Press，Inc.，2013:3480.

[4]景羽.雌酚酮及雌激素衍生物的合成研究[D].上海:上海師范大學，2010:1-93.