余波，李悅，朱春潮，楊曉紅，章潔，袁也豐，羅達亞△，徐方云△

(南昌大學1基礎醫學院，2公共衛生學院，3第一附屬醫院精神衛生科，江西南昌 330006)

江西地區漢族精神分裂癥與短串聯重復序列D6S285和D6S296多態性的關聯分析*

余波1，李悅2，朱春潮1，楊曉紅1，章潔1，袁也豐3，羅達亞1△，徐方云1△

(南昌大學1基礎醫學院，2公共衛生學院，3第一附屬醫院精神衛生科，江西南昌 330006)

目的:分析臨床患者短串聯重復(STR)序列D6S285和D6S296的基因多態性與精神分裂癥的關聯性，探討精神分裂癥發病學的分子機制。方法：選取江西地區漢族精神分裂癥患者100例為病例組，健康人群100例為對照組，采集血液樣本抽提DNA;采用毛細管電泳技術檢測分析STR位點D6S285和D6S296的各等位基因的分布，綜合運用多種遺傳學分析方法統計分析檢測結果。結果:(1)對照組D6S285和D6S296各等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05);(2)病例組D6S285-206等位基因的檢出率為6.60%，明顯低于對照組的13.70%(P＜0.05)，其相對危險度OR=0.448(OR＜1);病例組D6S285-212等位基因的檢出率為82.70%，明顯高于對照組的73.20%(P＜0.05)，其OR=1.748(OR＞1);(3)在D6S296位點上共檢測到18種等位基因，各等位基因的檢出率在兩組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論:人類6號染色體短臂上的D6S285位點附近可能存在與精神分裂癥有關聯的微效基因。

精神分裂癥;短串聯重復;基因多態性

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是人類最常見、最嚴重的精神性疾?。?］，發病率約為1%，主要表現為思維、情感與行為障礙以及精神活動與社會不協調。該病病程遷延反復，病后患者的學習、工作與生活均受到顯著影響，給社會和家庭帶來沉重的負擔。大量的證據已表明，遺傳因素是精神分裂癥的主要病因，其遺傳度約為60%～85%［2］，且屬多基因遺傳。此外還有眾多影響因素如人體必需微量元素的含量等［3］。由于存在生活和社會環境、不完全外顯以及遺傳異質性等諸多復雜因素的影響，至今對其易感基因及患病風險位點的定位仍不明確［4-7］。從已有的研究看，除少數可重復的陽性結果，如5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)受體、多巴胺D2(dopamine D2)受體基因多態性與精神分裂癥的關聯性已被多家研究機構證實［8］外，更多的是一些相互矛盾或不一致的研究結果。這些相互矛盾的結果也更進一步說明了該病的異質性和作為多基因遺傳的復雜性。

為了探究精神分裂癥的致病基因，世界各地的研究者付出了極大的努力。大量基因組掃描研究顯示:除了19號、21號和Y染色體以外，其余的染色體上都可能含有SZ的易感基因。近年來，國內外學者對精神分裂癥與6號染色體的關系尤其關注，且對6p22～24區域的研究中有較多的陽性報道［6-7］。

本實驗所檢測的2個位點D6S285與D6S296均位于第6號染色體的6p22～24區域。之所以選擇這2個侯選位點進行精神分裂癥的關聯研究，主要的理由是:(1)該區域已成為近年來眾多學者研究精神分裂癥易感基因的熱點區域。章潔等［9］在2010年的一項實驗研究中發現，人類6號染色體上D6S289及D6S1610兩位點可能與精神分裂癥相關聯，這2個位點均位于6p22～24區域;張咸寧等［10］和陳建芳等［11］的研究也提出了慢性精神分裂癥可能與人類6號染色體上D6S296位點關聯的證據;Moises等［12］對精神分裂癥的家系研究結果證實，在染色體6p區具有遺傳標記連鎖位點，有部分中國人精神分裂癥患者在D6S285處存在連鎖，但在歐洲人種中并未發現相應的遺傳標記連鎖位點。(2)到目前為止，國內外對D6S285和D6S296這2個微衛星標志與精神分裂癥關系的研究報道不多，而有關江西省漢族精神分裂癥與6號染色體上D6S285短串聯重復(short tandem repeat，STR)序列關聯性的研究迄今尚未見報道，故本實驗具有一定的創新性。

本研究采用STR技術，以江西地區漢族精神分裂癥患者為研究對象，以健康人群為對照，檢測其血液標本第6號染色體短臂上D6S285和D6S296各等位基因的頻率分布，探討基因多態性與精神分裂癥的關系，以期闡明精神分裂癥發病學的分子機制。

材料和方法

1 研究對象

1.1 精神分裂癥組精神分裂癥組病例均來自江西省精神病?？漆t院2010年至2011年間的住院患者，共收集精神分裂癥病例100例，其中男性54例，女性46例，平均年齡為(35.2±6.9)歲。

1.1.1 患者納入標準病例診斷按照國際疾病分類標準第10版精神分裂癥爭端標準(International Classification of Disease，10th Revision，ICD-10)，并參照中國醫學會精神科分會2001年出版的《中國精神障礙分類與診斷標準》第3版。無器質性精神障礙及其它精神疾病，病程在3個月以上。本實驗收集的樣本主要來自江西漢族地區年滿14～55歲的患者，同意參加本研究并取得病人及家屬或法定監護人的同意(簽署知情同意書并取得倫理委員會的同意)。

1.1.2 排除標準診斷不明確;伴有嚴重的軀體疾病和腦器質性疾病;精神發育遲緩、癡呆患者;有乙醇依賴和其它藥物依賴史;父輩、祖輩近親結婚或遷移入江西居住者。

1.2 健康人群對照組健康人群對照組全血標本均來自南昌大學第一附屬醫院檢驗科，系同一時期健康成人送檢的標本。共收集樣本100例，其中男性58例，女性42例，平均年齡(39.5±8.3)歲。

1.2.1 納入標準患者均來自于江西漢族地區并同意參加本次研究;本人及一級親屬無精神疾病及自殺史;無藥物依賴史及其它嚴重軀體疾病;志愿者間無親屬關系。

1.2.2 排除標準資料不齊全或者不愿意參加本次研究者。

2 方法

2.1 血液標本的采集與處理對符合入組標準的患者和對照組志愿者在征得其知情同意后，用含有EDTA抗凝的真空采血管抽取外周靜脈血3 mL，-20℃保存。

2.2 DNA提取采用百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取各樣品基因組DNA。

2.3 引物設計與配制通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov等人類基因組數據庫和Primer3軟件(http://www.sagb.co.uk)，設計各微衛星位點的熒光引物:D6S285位點5＇端標記N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基羅丹明(N，N，N'，N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine，TAMRA)，D6S296位點5＇端標記6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6FAM)，均委托上海生工公司完成。D6S285上游引物5＇-TAMRA-TGTGAAATGGAGAATGACACAGACA-3＇，下游引物5＇-TCCAATAGAAATCAAGCCCTGGTT-3＇;D6S296上游引物:5＇-6FAM-TCTATCCCAGGTTTCTCCAA-3＇，下游引物5＇-GCTTCATCTATAATCAAGACACTCA-3＇。

2.4 PCR擴增擴增體系:總體積20 μL，其中含有TaKaRa Taq(5×106U/L)0.1 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP 1.6 μL、DNA模板2 μL、上下游混合熒光引物1 μL和雙蒸水13.3 μL。反應條件:95℃變性5 min，分別為95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個循環，72℃10 min。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定取PCR產物5 μL，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以20 bp DNA Ladder Marker為分子量標準品(有13條帶，其中100 bp、200 bp 和500 bp 3條為指示帶，顯示亮帶)。電泳完畢后用Bio-Rad凝膠成像分析系統進行照相和保存。

2.6 毛細管電泳PCR產物的毛細管電泳按本實驗設計的要求，委托上海生工生物工程有限公司完成。

3 統計學處理

首先對檢測結果進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡檢驗，確定候選基因各個位點分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;再采用SPSS 16.0統計軟件進行數據的運算與處理，得出各等位基因的頻率，將病例組與對照組的各頻率進行組間比較分析，以P＜0.05為差異有統計學意義;最后計算相對危險度，OR=［Pd×(1-Pc)］/［Pc×(1-Pd)］(Pd為患者組基因頻率，Pc為對照組基因頻率)，OR＞1時判為有易感傾向，OR＜1時判為有抗性傾向。

結果

1 對照組D6S285和D6S296各等位基因Hardy-Weinberg平衡分析

經哈迪-溫伯格平衡檢驗，健康對照組人群D6S285和D6S296位點上各等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，表明所選擇的個體達到遺傳平衡。

2 D6S285和D6S296各等位基因檢出率及與SZ的關聯分析

(1)精神分裂癥病例組和健康對照組檢出D6S285共有7種等位基因，其片段大小在206～220 bp之間，具體瓊脂糖電泳和毛細管基因分型見圖1、2。經卡方檢驗分析后發現其中有2個等位基因頻率存在顯著差異，見表1。病例組D6S285位點206等位基因的檢出率為6.60%，對照組為13.70%，2組比較差異顯著(P＜0.05)，其OR=0.448(OR＜1);病例組D6S285位點212等位基因的檢出率為82.70%，對照組為73.20%，2組比較有顯著差異(P＜0.05)，其OR=1.748(OR＞1);后采用精確概率法加以驗證，發現上述2個陽性位點P值均為0.027(P＜0.05)，其余5個等位基因的檢出率經組間比較均無顯著差異(P＞0.05)。(2)2組檢出的D6S296共有18種等位基因，其片段大小在258～296 bp之間，具體瓊脂糖電泳和毛細管基因分型見圖3、4。各等位基因檢出率在2組間比較，均無顯著差異(P＞0.05)。在剔除不符合要求的研究數據后，我們又選擇了11個D6S285和D6S296的相關等位基因進行單倍體分析，單倍型頻率的比較采用精確概率法，結果亦無陽性發現，見表3。

Figure 1.The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products of D6S285 in the case group.M:DNA marker;1～7:the samples of the PCR amplification products.圖1 病例組D6S285位點PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Figure 2.The capillary electrophoresis figure of the D6S285-212 alleles in the case group.圖2 病例組D6S285位點212 bp等位基因片段毛細管電泳圖

表1 精神分裂癥與正常對照人群D6S285等位基因的關聯分析Table 1.The linkage analysis of the D6S285 alleles between the schizophrenia group and the control group

Figure 3.The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products of D6S296 in the case group.M:DNA marker;1～7:the samples of the PCR amplification products.圖3 病例組D6S296位點DNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

討論

本實驗選擇的研究區域為第6號染色體的6p22～24區域，所檢測的2個位點D6S285與D6S296均位于此，其中D6S285是位于第6號染色體短臂上6p22～24區域內一段短串聯重復序列。本研究觀察到2組的D6S285位點共檢出7種等位基因，其片段大小介于206～220 bp之間。通過采用2種不同的統計學分析方法均發現其中有2種等位基因頻率存在顯著差異，具體為:(1)精神分裂癥組D6S285位點206等位基因的檢出率顯著低于對照組，其OR值為0.448(OR＜1)，關聯分析提示D6S285上206等位基因位點附近可能存在精神分裂癥的保護基因;(2)精神分裂癥組D6S285位點212等位基因的檢出率顯著高于對照組，其OR值為1.748(OR＞1)，關聯分析強烈提示D6S285的212等位基因位點附近可能存在精神分裂癥的易感基因。本片段的其它5個等位基因檢出率在2組間比較均無顯著差異(P＞0.05)。該位點的檢測分析結果與Moises等［12］的報道相似，表明江西地區漢族精神分裂癥人群的D6S285位點附近可能存在與精神分裂癥有關聯的微效基因。

Figure 4.The capillary electrophoresis figure of the D6S296-264 and-274 alleles in the case group.圖4 病例組D6S296位點264 bp及274 bp等位基因片段毛細管電泳圖

表2 精神分裂癥患者與對照人群D6S296等位基因的關聯分析Table 2.The linkage analysis of the D6S296 alleles between the schizophrenia group and the control group

表3 精神分裂癥與正常對照人群D6S285與D6S296相關等位基因的單倍型分析Table 3.The haplotype analysis of the D6S285 and D6S296 alleles between the schizophrenia group and the control group

D6S296也是位于第6號染色體短臂6p22～p24區域上的一段短串聯重復序列，不同國家和地區對于該位點的研究報道均有所差異。Straub等［13］、張咸寧等［10］和陳建芳等［11］的研究認為慢性精神分裂癥可能與人類6號染色體上D6S296位點相關聯，但本研究的結果與他們的報道并不一致。本研究觀察到D6S296共有18種等位基因，其片段大小介于258～296 bp之間，通過對該位點進行單位點分析以及聯合D6S285與D6S296的相關等位基因進行單倍型關聯分析，均未能發現該位點上各等位基因在2組間存在顯著差異(P＞0.05)，提示該位點可能與江西地區漢族精神分裂癥人群的發病因素關聯性不強。我們分析這種差異可能與以下因素有關:(1)精神分裂癥是多基因遺傳疾病，存在顯著的異質性和復雜性，從而會導致不同實驗室、不同地區的研究結果存在較大差異;(2)本研究目前僅限于單個候選基因的關聯性研究策略模式，而靠單個STR位點進行關聯研究的統計效力較弱;(3)樣本的局限性也可能影響統計檢驗的效力;(4)參與本次研究的精神分裂癥患者的病程(急、慢性)參差不齊。因此，要確定D6S296與精神分裂癥的關聯關系，還需要加大樣本量、明確參與研究的精神分裂癥各亞型及病程、擴大采集樣本的研究區域以盡可能減少疾病的地區性差異和更多的人種研究等各個方面來提供證據支持。

精神分裂癥是一種高度異質性疾病，且屬于多基因遺傳。Maziade等［14］認為，精神分裂癥的遺傳特異性研究可能不單單是由一個特異的位點或者基因所決定的，而可能是由許多相關易感基因的特殊結合共同作用的。因此，就本研究結果而言，雖然發現D6S285的一些等位基因頻率有顯著差異，顯示可能存在著精神分裂癥的易感基因，但尚不能就此認定這些易感基因就是致病基因，且這種基因多態性也只是一個包含多種因素相互作用進而產生最終表型的復雜網絡的某一組成部分。因此，擴大樣本含量、增加多態位點的分析和提高相鄰基因的協同分析，并從基因表達及腦功能活動水平的層面來進一步探索微衛星DNA與精神分裂癥的關聯將顯得極為重要。

隨著全基因組關聯分析等新的研究手段的日漸成熟，未來會發現更多的候選基因，但距我們真正在分子遺傳學水平上揭密精神分裂癥的愿望還相差甚遠。如何在眾多候選基因中去蕪存菁?如何鑒別基因之間、基因與蛋白質之間以及基因與環境之間的復雜關系?這些都是研究者們今后需要面臨的更大挑戰。

［1］陳剛，溫曉燕，朱海寧，等.山東省濰坊東部地區精神分裂癥1號染色體基因掃描研究［J］.中華醫學遺傳學雜志，2007，24(3):288-292.

［2］周葦，萬紅嬌，楊翠萍.精神分裂癥相關基因的研究進展［J］.實用臨床醫學，2010，11(4):128-130.

［3］金禹權，玄希春，郭濟興，等.精神分裂癥患者頭發中鋅、銅、鉻的含量［J］.中國病理生理雜志，1989，5(1): 37，45.

［4］單可人，肖雁，陳卓，等.貴州苗族CBS基因與MTHFR基因多態性研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2009，17(4):16-18.

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Association between polymorphisms of short tandem repeats D6S285/ D6S296 and schizophrenia among the Han nationality in Jiangxi area

YU Bo1，LI Yue2，ZHU Chun-chao1，YANG Xiao-hong1，ZHANG Jie1，YUAN Ye-feng3，LUO Da-ya1，XU Fang-yun1
(1School of Basic Medical Sciences，2School of Public Health，3Department of Psychiatry，The First Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail:luodaya@hotmail.com;scbxu999@sina.com)

AIM:To analyze the association between the genetic polymorphisms of short tandem repeat(STR) sequences of D6S285/D6S296 and schizophrenia.METHODS:Schizophrenia patients of Han nationality in Jiangxi province(n=100)were selected as case group，and 100 normal people served as control group.DNA was extracted from the blood samples and the allelic frequency distribution of STR loci D6S285 and D6S296 was detected by capillary electrophoresis and analyzed by comprehensive genetic methods.RESULTS:The distribution of the alleles in D6S285 and D6S296 in control group was confirmed to match the Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05).The detection rate of D6S285-206 alleles in case group was 6.60%，which was obviously less than that in control group(13.70%，P＜0.05)，and the relative risk OR was 0.448(OR＜1).The detection rate of D6S285-212 alleles in case group was 82.70%，which was obviously higher than that in control group(73.20%，P＜0.05)，and the OR was 1.748(OR＞1).Eighteen alleles were detected at the D6S296 locus，but no statistically significant difference was found between the 2 groups(P＞0.05).CONCLUSION:The results indicate that minor genes associated with schizophrenia may exist at the D6S285 locus on the short arm of human chromosome 6.

Schizophrenia;Short tandem repeats;Genetic polymorphisms

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.013

1000-4718(2014)02-0268-06

2013-08-09

2014-01-01

國家自然科學基金資助項目(No.30860319;No.81160248)

△通訊作者羅達亞Tel:0791-86360581;E-mail:luodaya@hotmail.com;徐方云Tel:0791-88531697;E-mail:scbxu999@sina.com