大劑量苯巴比妥對驚厥幼鼠浦肯野細胞電生理功能的影響*

譚曉麗， 師長宏， 任穎鴿， 杜永平， 張月萍△

(第四軍醫大學1西京醫院兒科腦發育研究室，2實驗動物中心，3西京醫院全軍中醫內科中心，陜西西安 710032)

大劑量苯巴比妥對驚厥幼鼠浦肯野細胞電生理功能的影響*

譚曉麗1▲， 師長宏2▲， 任穎鴿1， 杜永平3△， 張月萍1△

(第四軍醫大學1西京醫院兒科腦發育研究室，2實驗動物中心，3西京醫院全軍中醫內科中心，陜西西安 710032)

目的：研究單次大劑量苯巴比妥對驚厥幼鼠小腦浦肯野細胞(Purkinje cells，PCs)電生理功能的影響。方法：將健康新生7 d(P7)SD幼鼠隨機分為正常對照組、驚厥模型組和苯巴比妥組。給予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg制作驚厥模型。苯巴比妥按120 mg/kg一次性腹腔注射。采用全細胞膜片鉗記錄法在小腦腦片上記錄小腦PCs動作電位及PCs興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)的長時程抑制(long-term depression，LTD)。結果：(1)苯巴比妥組幼鼠小腦PCs誘發動作電位的閾值降低，頻率增高。(2)苯巴比妥組幼鼠小腦PCs EPSC幅值在低頻刺激后15 min內降低的幅度顯著大于其它2組。結論：單次大劑量苯巴比妥增加了驚厥幼鼠小腦PCs的興奮性，并改變了小腦PCs的突觸功能。

苯巴比妥;驚厥發作;長時程抑制;浦肯野細胞

驚厥(convulsion)是新生兒時期常見的神經系統癥狀，其發生率為1.5‰～18‰［1］。苯巴比妥作為抗驚厥的一線藥物被廣泛應用于臨床。近年來，苯巴比妥可能對未成熟腦造成的不良影響備受關注［2］。臨床及動物實驗均已證實，母孕期使用苯巴比妥可導致胎兒小頭、生長發育遲滯、神經管缺損、唇腭裂和指趾畸形等宮內發育異常［3］。生后早期多次使用苯巴比妥(phenobarbital，PB)可顯著抑制未成熟腦的海馬區神經元新生細胞的增殖和存活［4］，甚至單次給予較大劑量苯巴比妥也會導致幼鼠的腦重量顯著減輕［5］。因此，治療新生兒驚厥時常規使用的苯巴比妥負荷量(20 mg/kg)對新生兒腦功能是否有不良影響亟待研究。本研究以臨床治療新生兒驚厥常用的負荷劑量為基礎，換算獲得苯巴比妥在新生幼鼠的用藥劑量［6］。在新生SD幼鼠的腦片上，觀察單次大劑量苯巴比妥對驚厥后幼鼠小腦主神經元浦肯野細胞(Purkinje cells，PCs)電生理特征和平行纖維(parallelfiber，PF)-PC突觸傳遞的影響。目的是闡明單次大劑量苯巴比妥對驚厥后幼鼠神經元興奮性和突觸功能的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑 NaCl、KCl、NaH2PO4·H2O、MgSO4· 7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖、葡萄糖酸鉀、HEPES、EGTA、磷酸肌酸二鈉、Na2ATP、Na3GTP、KOH和戊四氮均購自Sigma;PB由第四軍醫大學第一附屬醫院西京醫院提供。

1.2 溶液 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126.0，KCl 5.0，NaH2PO4·H2O 1.25，MgSO4·7H2O 2.0，CaCl2· 2H2O 2.0，NaHCO326.0，葡萄糖10.0，pH 7.35～7.45，滲透壓310～320 omOsm/L。電極內液成分(mmoL/L):葡萄糖酸鉀 120.0，KCl 5.0，HEPES 10.0，EGTA 5.0，CaCl2·2H2O 0.5，MgSO4·7 H2O 2.0，磷酸肌酸二鈉2.0，Na2ATP 4.0，Na3GTP 0.3，用0.5 mol/L KOH調pH為7.35～7.45，滲透壓285～300 omOsm/L。

1.3 儀器 振動切片機(VT1000S，Leica)，正置顯微鏡(Zeiss)，微電極操縱儀(Model 285)，放大器(Axon 700A)，模擬-數字轉換器(Digidata1322A)，電極拉制儀(P-97)，刺激器(PG4000A)，滲透壓測定儀(Model 210)，恒流泵(HL-2，上海瀘西儀器廠)。

2 方法

2.1 驚厥動物模型的制備及PB劑量的確認 健康新生7 d(P7)SD幼鼠由第四軍醫大學動物實驗中心提供。給予幼鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg，標準依據Racine分級標準［7］分為5級。選擇V級視為驚厥全面發作作為驚厥模型。PB治療新生兒驚厥的臨床負荷劑量是20 mg/kg，依據人與大鼠體表面積換算公式［6］確定幼鼠PB相當于臨床負荷量的劑量為120mg/kg，一次性腹腔注射給藥。

2.2 動物分組 正常對照組:SD幼鼠不制造驚厥模型，一次性腹腔注射與 PB等容積的生理鹽水(normal saline，NS);驚厥模型組(seizure):SD幼鼠驚厥全面發作后，一次性腹腔注射與PB等容積的生理鹽水;PB組:SD幼鼠驚厥全面發作后，一次性腹腔注射120 mg/kg PB。每組動物均為10只，各組幼鼠腹腔注射后30 min處死取小腦。

2.3 腦片制備 取各組SD幼鼠小腦，放入充95% O2+5%CO2混合氣的0℃ ACSF中，約1 min后取出，修整后移入切片槽內固定，用振動切片機切出300 μm厚腦片，立即轉移至32℃ ACSF中孵育約30 min，移至室溫下繼續孵育1 min后開始記錄。整個過程通以95%O2+5%CO2混合氣體。

2.4 全細胞膜片鉗記錄 將腦片移至記錄浴槽內，先在低倍鏡下確定小腦皮層的細胞層，再在高倍鏡下選擇表面光滑、輪廓清晰、立體感強的浦肯野細胞進行全細胞膜片鉗記錄。玻璃微電極充灌內液后電阻為7～9 MΩ，鉗制電壓為-70 mV。記錄過程中使用恒流泵持續向記錄浴槽內灌注含95%O2+5% CO2混合氣體的ACSF，流速為2 mL/min。在保持膜電位為-70 mV的電流鉗狀態下，通過向細胞內注射去極化電流(50～800 pA，100 ms)誘發記錄細胞的動作電位。用充有ACSF的玻璃微電極刺激小腦腦片的分子層，誘發并記錄小腦浦肯野細胞的興奮性突觸 后 電 流 (excitatory postsynaptic current，EPSC)。長時程抑制(long-term depression，LTD)則以一串頻率為1Hz的300個脈沖組成的低頻刺激(low-frequency stimulation，LFS)誘發，LFS刺激后的EPSC記錄時間為30 min以上，記錄期間膜鉗制電壓為-70 mV。

3 統計學處理

數據采集使用pCLAMP軟件，數據測量使用Clampfit軟件。數據應用Origin 8.0分析，以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因數方差分析檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 單次大劑量苯巴比妥對幼鼠小腦PCs興奮性的影響

在正常對照組腦片上，細胞內注射去極化電流誘發PCs動作電位的閾值為(172.90±13.21)mV。驚厥模型組的閾值為(165.20±10.64)mV，與正常對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖1B。苯巴比妥組的閾值為(113.60±13.64)mV，與正常對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見圖1B;與驚厥對照組相比也有顯著差異(P＜0.01)，見圖1B。同時，驚厥模型組誘發PCs動作電位的頻率較正常對照組升高(P＜0.05)，見圖1C。苯巴比妥組誘發PCs動作電位的頻率較正常對照組有顯著差異(P＜0.01)，見圖1C;與驚厥模型組相比也有顯著差異(P＜0.01)，見圖1C。這表明苯巴比妥組幼鼠小腦PCs興奮性較其它2組明顯升高。

Figure 1.Effect of phenobarbital on the excitability of the PCs in neonatal rats with seizures.A:the typical firing of PCs evoked by 400 pA current injection.The membrane potential was hold at-70 mV.B:the threshold of action potential of PCs.C: different current intensity-evoked firing rate of PCs.Mean±SD.n=11.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs seizure;#P＜0.05;##P＜0.01 vs control.圖1 苯巴比妥對驚厥幼鼠小腦PCs興奮性的影響

2 單次大劑量苯巴比妥對幼鼠小腦PF-PC突觸可塑性的影響

低頻刺激小腦PF，可使PCs EPSC呈現LTD。各組給予低頻刺激后EPSC幅值均明顯降低。正常對照組PCs的EPSC幅值在低頻刺激后15 min內逐漸降低到基線的(78.03±12.55)%，低頻刺激后持續穩定于該水平。驚厥模型組EPSC幅值在低頻刺激后15 min內降低到基線的(74.69±11.58)%，然后持續穩定于該水平。驚厥模型組EPSC幅值的下降幅度與正常對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2B;苯巴比妥組的幅值在低頻刺激后15 min內迅速降低到基線的(62.69±10.56)%，低頻刺激后15～30 min，EPSC幅值恢復到基線水平的(72.69± 9.58)%并穩定維持。苯巴比妥組EPSC幅值降低的程度在低頻刺激后的15 min內顯著大于正常對照組和驚厥模型組，均有顯著差異(P＜0.01)，見圖2B。而在低頻刺激后15～30 min，3組的幅值變化無顯著差異(P＞0.05)，見圖2C。這表明苯巴比妥改變了小腦PC的突觸活動。

討論

本研究發現單次大劑量使用苯巴比妥對驚厥幼鼠小腦PCs的影響有2個方面，一是導致PCs興奮性增高，二是改變了小腦PCs的突觸活動。

早先的臨床研究表明，苯巴比妥即使在常規用量和規范用藥的情況下仍可出現不良反應，加重驚厥的發作是其不良反應之一。黃鐵栓等［8］回顧總結了自1998年10月～2003年7月診治的服抗癲癇藥物后發作加重的45例兒童癲癇患者，其中因服用苯巴比妥加重發作者6例。蔣莉等［9］臨床研究也發現苯巴比妥在血藥濃度正常時可引起肌陣攣、肌強直發作增加。本研究結果顯示驚厥幼鼠使用苯巴比妥后PCs興奮性反比正常對照組和驚厥模型組增高，這可能是臨床上苯巴比妥加重驚厥的機制之一。苯巴比妥使驚厥幼鼠PCs興奮性增高的機制可能與未成熟腦γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)驅動的抑制系統不健全有關，即當GABA受體激活使Cl-通道開放時，由于未成熟腦神經細胞內Cl-濃度高于細胞外，導致Cl-外流，引起膜去極化，從而使神經元興奮性增高。此外，大劑量苯巴比妥可能抑制了小腦環路的抑制性中間神經元，使PCs脫抑制，從而導致閾值減低和放電頻率增加。

Figure 2.Effect of phenobarbital on EPSC LTD of the PCs in neonatal rats with seizures.A(left):pooled data for EPSC LTD of the PCs induced by low-frequency stimulation(LFS);A(right):the examples of average EPSC before and after LFS.Each waveform is the average of six traces(every 10 s).Black，red and blue represents EPSC before LFS，first 15 min after LFS and 15～30 min after LFS，respectively.B:normalized EPSC amplitude during the first 15 min after LFS(data from a shown in A);C:normalized EPSC amplitude during 15～30 min after LFS(data from b shown in A).Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs seizure.圖2 苯巴比妥對驚厥幼鼠小腦PCs EPSC LTD的影響

LTD是中樞神經系統突觸可塑性的一種重要模式［10］。小腦LTD在運動性學習記憶中起重要作用［11］。行為學研究發現圍產期暴露于苯巴比妥的鼠在八臂迷宮試驗、水迷宮試驗等空間學習實驗中顯示能力下降［12］。但是，苯巴比妥是否影響幼鼠小腦LTD的誘導尚未見報道。本研究結果發現單次給予大劑量苯巴比妥使PCs的EPSC在低頻刺激后早期下降的幅度顯著大于正常對照組和驚厥模型組，表明苯巴比妥改變了小腦LTD的表達模式。這一結果表明，即使是單次給予大劑量苯巴比妥也會改變小腦PCs的突觸功能，可能對幼鼠的學習和認知功能產生不良影響。

谷氨酸作為一種主要的興奮性神經遞質，通過受體介導的興奮性機制在驚厥的發生過程中具有重要作用［13］。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)是2種谷氨酸遞質門控受體亞型，每種亞型都是一種遞質門控離子通道，二者介導了腦內大多數快速興奮性突觸傳遞過程［14］。LTD的誘導與NMDA和AMPA的活動密切相關［15］。單次大劑量苯巴比妥引起的小腦LTD表達模式的改變提示其可能對NMDA和AMPA受體活動產生了影響。

綜上所述，單次大劑量苯巴比妥使驚厥幼鼠PCs興奮性增高，小腦LTD表達模式異常，可能是苯巴比妥加重驚厥和導致學習記憶障礙等不良反應的重要機制。本研究結果提示，臨床使用負荷量苯巴比妥治療新生兒驚厥時一定要嚴格掌握適應癥，以減少苯巴比妥對新生兒腦發育可能造成的不良影響。

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Effect of high-dose phenobarbital on electrophysiological characteristics of Purkinje cells in neonatal rats with seizures

TAN Xiao-li1，SHI Chang-hong2，REN Ying-ge1，DU Yong-ping3，ZHANG Yue-ping1
(1Laboratory of Brain Development，Pediatric Department，Xijing Hospital，2Laboratory Animal Center，3Department of Traditional Chinese Medicine，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China.E-mail: ypzhang@fmmu.edu.cn;ddyypp@fmmu.edu.cn)

AIM:To investigate the effect of single high-dose phenobarbital(PB)on the electrophysiological characteristics of cerebellar Purkinje cells(PCs)in neonatal rats with seizures.METHODS:Seven-day-old Sprague-Dawley neonatal rats were randomly divided into control group，seizure group and PB group.Seizures were induced by pentetrazole(60 mg/kg，ip)，and PB(120 mg/kg，ip)was applied to neonatal rats in PB group.The evoked action potential and excitatory postsynaptic current(EPSC)long-term depression(LTD)of the PCs were recorded by the technique of whole-cell patch clamp on the cerebellar slices.RESULTS:PB decreased the threshold of action potential in the PCs and increased the fire rate.During the first 15 min after stimulation，LTD was induced，and the inhibition of EPSC of the PCs was enhanced significantly by PB.CONCLUSION:Single high-dose PB increases the excitability of PCs and changes the synaptic functions of cerebellar PCs in the neonatal rats with seizures.

Phenobarbital;Convulsive seizures;Long-term depression;Purkinje cells

R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.025

1000-4718(2014)03-0529-05

2013-11-06

2014-01-14

國家自然科學基金資助項目(No.30871029);第四軍醫大學西京醫院助推計劃(No.XJZT10T07)

△通訊作者張月萍Tel:029-84773367;E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;杜永平Tel:029-84771307;E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn

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