原發性高血壓患者中抗α1腎上腺素受體自身抗體激活大鼠主動脈平滑肌細胞內NF-κB*

孫艷香， 袁 勇， 馮 力， 廖玉華， 朱 峰

(1中山大學附屬中山醫院心血管內科，廣東中山 528400;

2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心血管內科，湖北武漢 430022)

·短篇論著·

原發性高血壓患者中抗α1腎上腺素受體自身抗體激活大鼠主動脈平滑肌細胞內NF-κB*

孫艷香1△， 袁 勇1， 馮 力1， 廖玉華2， 朱 峰2

(1中山大學附屬中山醫院心血管內科，廣東中山 528400;

2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心血管內科，湖北武漢 430022)

目的：探討高血壓患者血清中抗α1腎上腺素受體自身抗體(autoantibodies against α1-adrenergic receptor，α1-AAs)擬去甲腎上腺素的激動樣效應及胞內信號分子活化機制。方法：培養大鼠主動脈平滑肌細胞。將收集的原發性高血壓病人血清進行免疫親和層析法純化，ELISA檢測其滴度后以1∶80刺激細胞，并設立不同的處理組。將α1-AAs刺激大鼠主動脈平滑肌細胞后，經Western blotting及免疫熒光方法分析胞內核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號分子激活及表達狀況。結果：Western bltting顯示α1-AAs刺激組中胞內核因子NF-κB (p50)表達較空白對照組明顯增強，且可被α1受體阻滯劑哌唑嗪和NF-κB拮抗劑PDTC明顯抑制(P＜0.05)。免疫熒光實驗中，α1-AAs組熒光強度顯著高于空白對照組和α1-AAs+哌唑嗪組(P＜0.01)。結論：高血壓患者血清中α1-AAs能夠致大鼠主動脈平滑肌細胞NF-κB活化。

高血壓;α1腎上腺素受體;自身抗體;NF-κB

α1腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor)在人體許多生理調控過程中起到重要的作用，尤其是在心血管活動中，其中包括對平滑肌收縮、心肌變時和變力以及血壓的調節［1］。同時，已有報道在原發性高血壓、惡性高血壓及難治性高血壓患者血清中發現抗 α1腎上腺素受體自身抗體(autoantibodiesagainst α1-adrenergic receptor，α1-AAs)的存在［2-3］。實驗驗證該自身抗體可導致動物心肌細胞肥厚和細胞間質的增加［4］，且后來的臨床統計也發現高血壓患者中 α1-AAs參與了高血壓患者左心室重構［5］。而眾多研究并未闡明α1-AAs介導的胞內分子機制，因此本研究主要探討該自身抗體對血管平滑肌細胞內信號分子及炎癥因子NF-κB的激活情況。

材料和方法

1 病例及試劑

參照2010年中國高血壓防治指南高血壓診斷標準。血標本抗凝后離心取上清，選取經檢測后α1-AAs陽性的原發性高血壓患者(24例)血清。培養基DMEM及新生牛血清購自 Gibco;BSA、CNBr-Sepharose、HRP-IgG及NC膜購自武漢凌飛公司;抗NF-κB(p50)抗體及 β-actin均購自 Cell Signaling;哌唑嗪 (prasozin，PN)和吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)購自Sigma。

2 α1-AAs的檢測及純化

用ELISA［6］檢測自身抗體滴度，即:多肽合成儀人工合成人α1腎上腺素受體胞外第2肽段(192～218 aa)［6］，將合成的α1腎上腺素受體抗原肽包被96孔酶聯板，純化后的α1-AAs為I抗并以不同稀釋倍數(1∶40、1∶80和1∶160)稀釋，IgG-HRP為酶標II抗，TMB/H2O2顯色，于450 nm波長測定吸光度(A)。實驗中設立空白對照和陰性對照，測A值時以空白對照調零。抗體定性判斷以P/N≥2.1為陽性［P/N=(標本血清組A值-空白對照A值)/(陰性對照組A值-空白對照A值)］。以親和層析法純化血清中的自身抗體，具體步驟可參考本課題組以前的相關文獻資料［7］。

3 細胞培養及免疫印跡檢測

Wistar雄性大鼠經頸總動脈放血后，在無菌條件下迅速取出胸主動脈行組織塊法培養;原代細胞經α2-actin鑒定呈陽性染色。細胞在無血清培養基中培養24 h后用α1-AAs 1∶80滴度進行刺激并分組，后提取蛋白，并按BCA法測定各樣本蛋白濃度。將樣品加入上樣緩沖液煮沸10 min后上樣。以200 V、10%的SDS-PAGE分離膠電泳40 min，100 V轉膜45 min。用5%脫脂奶粉封閉1 h后洗膜15 min×3，加I抗4℃孵育過夜。再洗膜15 min×3，II抗室溫孵育1 h。洗膜15 min×3后ECL發光。

4 免疫熒光實驗

細胞爬片后在無血清培養基中培養24 h后分3組進行刺激，分別為空白對照組、α1-AAs刺激組及先PN抑制后加用α1-AAs刺激組。取出細胞爬片后用PBS洗細胞2次并吸干，用丙酮在冰上固定10～15 min，然后用0.1%Triton X-100透化固定細胞1 min，PBS洗3次;以1∶100加入抗NF-κB(p50)I抗(用5%BSA/PBS稀釋)室溫孵育2 h，再用PBS洗細胞3次加入熒光標記的II抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，在熒光顯微鏡下照相。

5 統計學處理

用SPSS 10.0軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 血管平滑肌細胞鑒定結果

顯微鏡下可見細胞呈典型的“峰-谷”樣生長，免疫細胞化學染色顯示細胞內 α2-actin呈陽性，見圖1。

Figure 1.The identification of rat VSMCs by immunocytochemistry(×400).圖1 大鼠血管平滑肌細胞的鑒定

2 α1-AAs刺激平滑肌細胞內信號分子NF-κB的激活及核轉移

不同處理組細胞的裂解蛋白經Western blotting，結合圖形灰度分析可看出:α1-AAs刺激組NF-κB較α1-AAs+PN、α1-AAs+PDTC及空白對照組表達明顯增高(P＜0.05)，而稍弱于去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)組(P＞0.05)，見圖2。這表明在α1-AAs可導致胞內分子NF-κB的激活，并被α1受體拮抗劑PN和NF-κB特異性阻滯劑PDTC所抑制。

進一步用抗NF-κB抗體通過細胞免疫熒光檢測其在不同處理組間細胞核內分子的表達情況:對照組細胞中NF-κB主要存在于胞漿及很少一部分位于胞核周邊;α1-AAs刺激30 min后，NF-κB表達逐漸趨于核周間隙，核內表達明顯高于空白對照組(P＜0.01);而先用α1受體拮抗劑PN作用后再加α1-AAs刺激則核內NF-κB分子表達量顯著下降(P＜0.01)，見圖3。上述結果表明α1-AAs能促進胞內NF-κB p50向細胞核內轉移，且被α1受體拮抗劑所拮抗。

Figure 2.The activation of NF-κB(p50)in response to α1-AAs.PN:prazosin(1 μmol/L);PDTC:pyrrolidine dithiocarbamate(0.1 mmol/L);NE:norepinephrine (100 μmol/L).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control，α1-AAs+PN and α1-AAs+PDTC.圖2 NF-κB分子在平滑肌細胞內的激活情況

Figure 3.The expression of NF-κB(p50)in VSMCs in different groups detected by immunofluorescence(×400).MFI:mean fluorescence intensity.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs α1-AAs.圖3 免疫熒光細胞染色顯示NF-κB(p50)在胞核內的表達

討論

近年來，免疫因素在高血壓的發病中起到越來越重要的作用，其中自身抗體在高血壓患者中的研究較多。Fu等［2］首先在惡性高血壓患者血清中發現α1-AAs的存在;后在原發性高血壓患者血清中也檢測到該抗體［3］。α1受體屬G蛋白偶聯受體超家族，在機體心血管的調節中起著十分重要的作用。α1-AAs具有類似去甲腎上腺素樣激動性作用，可能參與高血壓的發生發展及其所致靶器官的損害，且由于該抗體在惡性高血壓及難治性高血壓病人血清中的檢出率可達到25.3%［8］，所以闡明該抗體作用于血管平滑肌細胞胞內信號分子機制的激活情況很有必要。

NF-κB分子是大多數炎癥因子及活性物質發揮生物作用的通路，由p50和p65兩個亞基組成，靜止狀態下與抑制性蛋白IκB結合，當細胞在受某些刺激后則與 IκB分離而轉入胞核從而調控基因表達［9-10］。NF-κB信號轉導通路常見且已有研究報道該分子參與多種細胞增殖及抗凋亡的調控［11］。活化的NF-κB可單獨或與其它轉錄因子協同，對眾多基因尤其是涉及炎癥和免疫反應等方面的基因表達起著關鍵性的調控作用［12］，從而誘導許多因子的轉錄。

本實驗結果顯示α1-AAs刺激大鼠主動脈平滑肌細胞后可致胞內NF-κB分子活化且向核內轉移及表達量增加，顯著高于哌唑嗪或PDTC拮抗組及空白對照組，而稍低于去甲腎上腺素刺激組，表明NF-κB信號分子途徑的激活參與了α1-AAs所致的激動樣效應，從而可能介導平滑肌細胞增殖、血管炎性反應及心血管重構等。但從結果中也可看到，NF-κB特異性受體拮抗劑PDTC和α1受體拮抗劑哌唑嗪并不能完全抑制該自身抗體刺激后細胞內NF-κB分子的表達，從而可以推測NF-κB分子的激活可能只是該激動性自身抗體作用于自身受體后介導的胞內活化信號分子通路之一。

至于α1-AAs的產生機制，推測該抗體可能產生于高血壓引起血管損傷后的免疫反應，由于血管損傷，內源性抗原暴露，使α1受體的抗原性發生改變，激活自身反應性T細胞，從而產生自身抗體;我們課題組也報道其產生與其受體基因多態性相關，可能是環境與遺傳因素共同作用的結果［13-14］。

總之，本實驗顯示原發性高血壓患者血清中激動性α1-AAs可能通過激活血管平滑肌細胞內NF-κB分子而調節下游信號分子的表達，結合前述的其它信號途徑如該自身抗體與受體結合后促使AP-1激活并誘導原癌基因c-jun和c-fos表達［6］，從而一起介導細胞增殖和血管炎癥反應的發生。對該信號機制的研究進一步在分子水平上奠定了免疫機制在高血壓病中的作用，并為α1-AAs所致的類似NE激動樣效應提供了理論依據;同時我們可以通過對NF-κB通路的調節為臨床抗血管炎癥及其所致的血管重塑、靶器官重構提供新的治療思路。

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Activation of NF-κB in rat vascular smooth muscle cells by autoantibodies against α1-adrenergic receptor from hypertensive patients

SUN Yan-xiang1，YUAN Yong1，FENG Li1，LIAO Yu-hua2，ZHU Feng2
(1Department of Cardiovascular Medicine，Zhongshan Hospital，Sun Yat-sen University，Zhongshan 528400，China;2Department of Cardiology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China.E-mail:syx1298509@163.com)

AIM:To study the effects of autoantibodies against α1-adrenergic receptor(α1-AAs)isolated from the hypertensive patients，which showed the agonist-like activity similar to norepinephrine，on the signal mechanism of vascular smooth muscle cells(VSMCs)isolated from rat thoracic aorta.METHODS:Rat VSMCs were cultured and identified.The serum of hypertensive patients was purified by immunoaffinity chromatography.The autoantibodies were detected by ELISA and used to activate the cells with the titer of 1∶80.The total protein was extracted and the expression of NF-κB in different treatment groups was detected by Western blotting.Meanwhile，the activation of NF-κB in the nucleus was analyzed by immunofluorescence method.RESULTS:The expression of NF-κB in VSMCs was obviously higher in α1-AAs group than that in control group.Meanwhile，the expression of NF-κB was inhibited by prasozin and PDTC.The autoantibodies caused a significant increase in NF-κB expression in the nucleus.The fluorescence intensity in α1-AAs group was high than that in control group and α1-AAs+prasozin group(P＜0.01).CONCLUSION:The α1-AAs from hypertensive patients increase NF-κB expression in rat VSMCs.

Hypertension;α1-adrenergic receptors;Autoantibody;NF-kappa B

R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.022

1000-4718(2014)03-0514-04

2013-09-18

2013-12-24

國家自然科學基金資助項目(No.C03030201);中國博士后科學基金資助項目(No.20100470982)

△通訊作者Tel:0760-89880246;E-mail:syx1298509@163.com