胡 波， 施資堅， 王 遙， 劉坤鵬， 潘 浩， 尹良紅△

(暨南大學1附屬第一醫院腎內科，2生命科學技術學院免疫生物學系，廣東廣州 510632)

雪膽素乙誘導刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴細胞凋亡及其機制的研究*

胡 波1， 施資堅1， 王 遙2， 劉坤鵬2， 潘 浩2， 尹良紅1△

(暨南大學1附屬第一醫院腎內科，2生命科學技術學院免疫生物學系，廣東廣州 510632)

目的：分析雪膽素乙(CuIIb)對刀豆蛋白A(Con A)刺激的小鼠淋巴細胞體外凋亡的影響，并探討其作用機制。方法：以Annexin V染色結合流式細胞術分析小鼠淋巴細胞凋亡情況;利用JC-1染色分析淋巴細胞線粒體膜電位變化;Western blotting檢測凋亡相關蛋白變化。結果：CuIIb處理后，早期和中期凋亡細胞比例明顯增加，淋巴細胞線粒體膜電位降低。同時，CuIIb以劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并明顯降低抗凋亡蛋白survivin的表達。結論：CuIIb誘導淋巴細胞凋亡，其機制可能與其降低線粒體膜電位、激活caspase-3凋亡通路有關。

雪膽素乙;淋巴細胞;刀豆蛋白A

雪膽素乙(cucurbitacin II b，CuIIb)是從葫蘆科雪膽屬植物雪膽(Hemsleya amalils Diels)中提取的一種四環三萜類化合物，是葫蘆素家族的一個成員，化學名為23，24-雙氫葫蘆素F［1］。自古以來，我國西南各民族用雪膽治療菌痢、腸炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等炎癥相關疾病。作為民族藥，其具有清熱解毒、抗菌消炎的功效［2-3］。雪膽塊根中提取物制備為雪膽素片(含雪膽素甲和乙)已在臨床用于治療菌痢和腸炎等疾病，但其抗炎作用的機制尚不清楚。前文以刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)激活的小鼠淋巴細胞為模型［4］，發現CuIIb能有效影響淋巴細胞體外活化、增殖以及炎癥因子的表達，但分子機制仍有待進一步研究。本研究以體外活化的小鼠淋巴細胞為模型，分析了CuIIb對活化小鼠淋巴細胞凋亡的影響，探討其作用機制。

材料和方法

1 材料

清潔級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自南方醫科大學實驗動物中心。CuIIb (純度98%)，購自上海順勃生物技術公司。Con A和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich。RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、L-谷氨酰胺和β-巰基乙醇購自 Gibco/Invitrogen。5，5＇，6，6＇-tetrachloro-1，1＇，3，3＇-tetraethyl-benzimidazolcarbocyanine iodide(JC-1)和 RNase A購自Carlsbad。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自Becton Dickinson。CuⅡb用DMSO配制成0.02 mol/L的儲存液，-20℃保存待用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、DNA雙鍵斷裂標志物H2AX(γ-H2AX)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly-(ADP-ribose)polymerase，PARP］、Bcl-2、survivin等抗體均購自Cell Signaling。

2 方法

2.1 小鼠淋巴細胞分離培養 頸髓脫臼處死小鼠，無菌分離小鼠頸部、腋下以及腹股溝淋巴結，置于盛有預冷的PBS的無菌平皿中，除去被膜，以200目尼龍網濾過，收集的細胞用PBS洗滌2遍(1 500 r/min離心5 min)，用RPMI-1640完全培養基(25 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、50 μmol/L β-巰基乙醇和10%FBS)調整細胞密度為2×109/L，接種于24孔板中(每孔500 μL)在37℃、5%CO2條件下培養。

2.2 Annexin V-PE染色 收集不同濃度CuIIb處理24 h的淋巴細胞，用冷PBS洗2次，將細胞重懸于100 μL 1×結合緩沖液，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，25℃ 避光放置15 min，再加入300 μL的結合緩沖液，立即上機分析。

2.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位 各實驗組培養24和48 h后，離心收集細胞，棄上清，用500 μL培養基重懸細胞，加入500 μL JC-1工作液，JC-1終濃度為2.5 mg/L，細胞培養箱中37℃ 避光孵育20 min，離心，棄上清，冷 PBS洗滌2次，再加入冷PBS 300 μL，重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

2.4 免疫印跡 收集 CuIIb(5和10 μmol/L)處理24 h的小鼠淋巴細胞，用RIPA裂解細胞獲得總蛋白［5］，隨后取適量樣品應用BCA試劑盒測量蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，每個樣品上樣40 μg蛋白，電泳后轉移蛋白至PVDF膜。將膜轉置5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，TBS+Tween洗膜3×5 min。加入以5%BSA稀釋的I抗，置4℃搖床過夜。洗膜后再分別與相應的II抗(5% 脫脂牛奶稀釋)室溫孵育1 h，洗膜3次。最后用BeyoECL Plus化學發光試劑盒(碧云天)顯色，X光片感光顯影，FluorChem 800 (Alpha Innotech)成像儀記錄結果并以Alpha EASE FC軟件分析結果。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)，用GraphPad Prism 4.0軟件進行單因素方差分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 CuIIb引起活化的淋巴細胞凋亡

流式細胞術分析結果見圖1，Con A刺激組凋亡細胞比例為39.92%，明顯低于對照組;而2.5、5和10 μmol/L CuIIb均能明顯增加凋亡細胞比例，與Con A組相比差異明顯，并具有劑量依賴性。

2 CuIIb對小鼠淋巴細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位結果見圖2，CoA組線粒體膜電位明顯低于對照組(P＜0.01);而與 Con A 組(37.96%)相比，Con A+10 μmol/L CuIIb組線粒體膜電位(45.29%)顯著上升 (P＜0.05)，而CuIIb濃度度為2.5和5 μmol/L時線粒體膜電位與CoA組差異不顯著。

3 CuIIb促進小鼠淋巴細胞caspase-3的活化

免疫印跡結果表明(圖3)，藥物作用24 h后，10 μmol/L CuIIb能夠明顯促進caspase-3活化(即產生cleaved caspase-3)和γ-H2AX水平升高，表明在激活的淋巴細胞內，雪膽素乙誘導了DNA損傷。另外，PARP上升幅度不高，抗凋亡蛋白Bcl-2未受雪膽素乙處理的影響，而細胞周期調控的凋亡抑制蛋白survivin水平顯著下調。這些結果表明，雪膽素乙通過誘導DNA損傷、抑制survivin表達來促進細胞凋亡。

Figure 1.CuIIb induced apoptosis of Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs Con A group.圖1 CuIIb引起活化的小鼠淋巴細胞凋亡

Figure 2.CuIIb induced cell apoptosis with reduced mitochondral membrane potential in Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean± SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs Con A group.圖2 CuIIb對小鼠淋巴細胞線粒體膜電位的影響

Figure 3.Effects of CuIIb on the levels of cleaved caspase-3，PARP，phosphorylated H2AX(γ-H2AX)，Bcl-2 and survivin in Con A-stimulated lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Con A group.圖3 CuIIb對小鼠淋巴細胞凋亡相關蛋白及survivin表達的影響

討論

淋巴細胞在適應性免疫應答中發揮核心作用，淋巴細胞的活化、增殖及促炎因子的釋放等細胞行為是免疫應答的基礎和關鍵事件，在免疫防御、免疫調節、炎癥發生及自身免疫疾病中都發揮重要作用。本研究表明CuIIb能夠誘導T淋巴細胞凋亡，并可能與CuIIb以劑量依賴方式影響凋亡相關蛋白的表達有關，提示CuIIb抗炎可能與其誘導淋巴細胞凋亡有關。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，能直接抑制caspase-3和caspase-7的活性，阻斷細胞的凋亡過程。目前研究認為可能是通過以下途徑實現的: survivin能與激活的caspase-3和caspase-7結合，阻止由 caspase激活劑或凋亡誘導劑誘導的細胞DEVD-cleaving自殺酶的積累，抑制了caspase的級聯反應，從而阻止腫瘤細胞凋亡［6］;survivin也可通過p21間接抑制caspase，其機制可能為survivin與細胞周期調控因子CDK4形成survivin-CDK4復合體，使得p21從CDK4的復合體中釋放出來，p21進一步與線粒體caspase-3結合，抑制其活性，阻止細胞凋亡［7］。我們的結果顯示在Con A刺激活化的T淋巴細胞中，雪膽素乙處理后，淋巴細胞抗凋亡蛋白survivin的下調，促使caspase-3從復合體中釋放，從而進一步提高其活化水平，促進了細胞的凋亡。

線粒體在誘導細胞凋亡中的作用已經被證實［8-10］。在特定凋亡誘導環境中，線粒體膜電位水平下調，導致膜通透性增加，啟動凋亡相關的細胞色素C釋放［11］，線粒體膜電位水平下調與線粒體依賴性的早期凋亡相關。另外，當DNA損傷發生，H2AX被快速磷酸化，并招募其它修復因子聚集在損傷部位，因此被作為DNA雙鏈斷裂的標志［12-13］。本文結果顯示雪膽素乙處理細胞后會提高DNA雙鍵斷裂標志物γ-H2AX的水平，表明在淋巴細胞中，雪膽素乙誘導細胞凋亡是通過刺激DNA雙鍵斷裂來實現的。同時，體外培養的淋巴細胞會發生自發性凋亡，因此未經Con A刺激的淋巴細胞也表達較高水平的活化caspase-3和PARP。Con A刺激可使淋巴細胞增殖，因此ConA的刺激降低了淋巴細胞的自發凋亡。

綜上所述，CuIIb能夠明顯促進體外培養Con A活化的小鼠淋巴細胞凋亡，并通過CuIIb劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并下調抗凋亡蛋白survivin表達。

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Cucurbitacin IIb induces apoptosis of concanavalin A-activated mouse lymphocytes

HU Bo1，SHI Zi-jian，WANG Yao2，LIU Kun-peng2，PAN Hao2，YIN Liang-hong1
(1Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital，2Department of Immunobiology and Department of Cell Biology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:yin-yun@126.com)

AIM:To explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying mechanism of cucurbitacin II b(CuIIb)on concanavalin A(Con A)-activated mouse lymphocytes.METHODS:The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V staining.The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining.The levels of caspase-3，phosphorylated H2AX and survivin were detected by Western blotting.RESULTS:Compared with Con A-activated lymphocytes，the significant increases in the proportion of the cells with reduced mitochondrial membrane potential or with increased Annexin V staining were observed，reflecting increased apoptosis in CuIIb plus Con A-treated cells.The increased levels of activated caspase-3 and phosphorylated H2AX(a marker of double-stranded DNA breaks)were manifested in Con A-activated cells co-treated with CuIIb.Although only a slight difference of cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase was found in the cells with or without CuIIb treatment，the expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，was markedly reduced by CuIIb in Con A-activated cells.CONCLUSION:CuIIb promotes apoptosis in mouse lymphocytes.

Cucurbitacin II b;Lymphocytes;Concanavalin A

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.021

1000-4718(2014)03-0509-05

2013-10-27

2014-01-10

科技部專項技術基金資助項目(No.2006AA02Z4D8)

△通訊作者Tel:020-38688502;E-mail:yin-yun@126.com