隔核ghrelin對糖尿病胃動力障礙大鼠胃運動影響及下丘腦弓狀核的潛在調控機制*

閆長虹， 徐 珞， 高勝利， 郭菲菲， 孫向榮， 公衍玲

(1青島大學醫學院病理生理教研室，山東青島 266021;2菏澤醫學?？茖W校，山東菏澤 274099;3青島科技大學化工學院，山東青島 266042)

隔核ghrelin對糖尿病胃動力障礙大鼠胃運動影響及下丘腦弓狀核的潛在調控機制*

閆長虹1，2， 徐 珞1△， 高勝利1， 郭菲菲1， 孫向榮1， 公衍玲3

(1青島大學醫學院病理生理教研室，山東青島 266021;2菏澤醫學?？茖W校，山東菏澤 274099;3青島科技大學化工學院，山東青島 266042)

目的：研究隔核ghrelin對糖尿病(DM)大鼠胃運動的調控，并探討下丘腦弓狀核與隔核間ghrelin通路對胃運動的調控機制。方法：鏈脲佐霉素腹腔注射制備DM大鼠模型;熒光免疫組化和real-time PCR方法檢測DM大鼠隔核內ghrelin受體GHS-R1a表達變化;大鼠胃表面固定感應片在體記錄胃運動并計算胃運動變化率;熒光金逆行示蹤方法顯示下丘腦弓狀核和隔核間纖維聯系，并采用中樞注射藥物、核團損毀或電刺激等方法觀察核團纖維聯系對DM大鼠胃運動的調控作用。結果：(1)DM大鼠隔核GHS-R1a表達低于正常大鼠(P＜0.05)，胃運動明顯減弱，胃收縮幅度和頻率顯著降低(P＜0.05)。(2)隔核注射ghrelin增強正常和DM大鼠胃運動(P＜0.05)，且呈量效關系。(3)熒光金在注射入隔核7 d后逆行至弓狀核內神經元，其中部分神經元為ghrelin免疫陽性神經元;(4)正常大鼠體內，損毀隔核對胃運動和電刺激弓狀核引起的胃運動變化無顯著影響(P＞0.05);而對DM大鼠，損毀隔核減弱胃運動和電刺激弓狀核后胃運動(P＜0.05)。(5)隔核微量注射ghrelin受體阻斷劑［DLys-3］-GHRP-6未顯著改變正常大鼠電刺激弓狀核后胃運動變化(P＞0.05)，但可減弱DM大鼠電刺激弓狀核引起的胃運動變化(P＜0.05)。結論：隔核ghrelin和下丘腦弓狀核-隔核間ghrelin通路在糖尿病大鼠胃運動調控中發揮重要作用。

糖尿病;隔核;下丘腦;胃運動;Ghrelin

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝疾病，隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以及肥胖發生率的增加，DM的發病率呈逐年上升趨勢。DM患者常伴有胃腸運動障礙［1］，臨床表現為胃弛緩與胃潴留，嚴重者可發生糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)。DGP典型癥狀為腹脹、早飽、厭食、噯氣、惡心、嘔吐、體重減輕，長期患病除導致營養不良外，還可影響血糖控制和糖尿病繼發器官病變，成為降低患者生活質量的重要并發癥［2］。但目前糖尿病性胃腸運動障礙病因尚不特別明確，可能與胃腸道平滑肌、植物神經改變等外周因素［3-4］有關，但目前腦腸肽(如ghrelin、胃動素、nesfatin-1等)中樞機制研究逐漸成為焦點，尤其與情緒活動相關的邊緣系統，如隔核、海馬在胃腸功能調控作用倍受關注。本研究將采用免疫熒光組化、real-time PCR、熒光逆行示蹤、胃運動記錄等方法觀察DM大鼠胃腸運動變化及ghrelin對DM大鼠胃運動刺激作用，探討下丘腦攝食相關中樞弓狀核與隔核之間ghrelin神經通路的調節作用。

材料和方法

1 動物分組及模型制備

采用健康成年雄性SD大鼠(由青島市藥檢所提供)260只，體重230～300 g，置于室溫25℃ ±2℃，12 h/12 h晝夜循環光照條件下生活，自由攝食、飲水。隨機取180只制作DM大鼠模型，另有80只正常大鼠。所有動物實驗均符合《青島大學實驗動物保護和使用管理辦法》。

參照Wei等［5］方法制作大鼠糖尿病模型。造模前禁食(不禁水)12 h;造模組大鼠腹腔注射新鮮配制 1% 鏈脲佐霉素 (streptozotocin，STZ;Sigma-Aldrich;65 mg/kg)，對照組大鼠注射1 mL檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L)。4周后，篩選DM大鼠成功模型，篩選標準為血糖濃度＞15 mmol/L，且出現煩渴、多尿和體重下降等癥狀。

DM大鼠模型共有94只(52.2%)，其中16只大鼠用于觀察 ghrelin受體 GHS-R1a(growth hormone secretagogue receptor 1a)及其mRNA在隔核的表達，6只大鼠采用熒光金逆行示蹤技術探討下丘腦弓狀核ghrelin神經元向隔核的投射，72只大鼠用于觀察胃運動改變。

3 在體胃運動實驗

3.1 隔核埋管術及核團注射 大鼠禁食15～20 h，硫巴比妥鈉 (200 mg/kg;Sigma-Aldrich)腹腔麻醉。用牙科鉆在顱骨表面鉆孔，清除腦膜，參照Paxinos-Watson大鼠腦圖譜［6］，將自制不銹鋼套管(長25 mm，外徑0.7 mm，內徑0.4 mm)置入隔核(前囟1.8～-0.8 mm，中線旁開0～1 mm，顱骨表面下5.5～5.8 mm)，牙托粉固定。將一小螺絲釘固定于顱骨表面，用502膠和自凝牙托粉混合固定套管，并置入不銹鋼內芯以防阻塞。

核團內微量注射:微量注射器尖端伸出套管2 mm進入核團，將待注射藥物在3 min內緩慢注射完畢，留針3 min。Ghrelin(G3902)和［D-Lys3］-GHRP-6(G4535)均購于Sigma-Aldrich。

實驗結束后，用微量注射器經核團內注射1 μL滂胺天藍，隨后用4%多聚甲醛經心臟灌注固定，快速斷頭取腦，4%多聚甲醛浸泡24 h后冰凍切片，對照圖譜觀察微量注射套管尖端的定位，位置不正確者棄去。

3.2 胃應力傳感器植入術 劍突下行腹部正中切口，充分暴露胃，在距離幽門0.5 cm處，將應力傳感器(應變片)沿縱行肌方向縫貼于胃竇漿膜面，絕緣導線經皮下引至頸后部皮膚切口，穿出體外。逐層關閉腹腔，縫合。術后每日腹腔注射青霉素2×104U。術后3 d，待動物恢復正常飲食，無任何疼痛和應激反應現象，即可進行實驗。

3.3 麻醉大鼠胃運動記錄 實驗前動物禁食15～20 h，自由飲水。實驗時大鼠硫巴比妥鈉腹腔麻醉。用成都儀器廠RM-46胃運動記錄儀連續描記胃運動曲線。胃運動信號經傳感器將胃運動應力變化轉為電信號，傳至計算機，通過計算機即時收集胃腸運動數據，由記錄儀軟件做實驗后數據處理。

胃運動變化率的計算公式:胃運動指數(motility index，MI)=5 min內胃運動曲線下面積，胃運動變

4 Real-time PCR

總RNA的提取和單鏈 cDNA(single-stranded DNA，ss-cDNA)合成參照文獻［7］進行。采用Premier 6.1(PREMIER Biosoft)設計引物(表1)，所有PCR引物均由Life Technologies公司合成。

取1 μL ss-cDNA產物作為待測樣本，采用SYBR Green I定量 PCR試劑盒(TaKaRa)分別對GHS-R1a、ghrelin、神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)、食欲素(orexin)和GAPDH進行擴增(擴增條件:95℃ 15 s，64℃1 min，共40個循環)，隨后對PCR產物進行熔解曲線分析。以不含ss-cDNA模板的PCR反應體系設為陰性對照。通過比較 GHS-R1a與GAPDH的Ct值進行定量:ΔCt=CtGHS-R1a-CtGAPDH。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

5 神經元逆行示蹤與熒光免疫組化染色

成年健康及DM大鼠各取6只，硫巴比妥鈉腹腔麻醉，參照Paxinos-Watson圖譜，定位隔核(同前)，用1 μL微量注射器緩慢注入0.2 μL 3%熒光金(Sigma-Aldrich)。大鼠放入籠中飼養7 d，麻醉狀態下經心灌注固定(4%多聚甲醛)，斷頭取腦，參照Paxinos-Watson圖譜行冰凍切片(20 μm)。切片經4%正常羊血清/0.5%Triton X-100/PBS孵育2 h，與山羊抗ghrelin(1∶200，sc-10368，Santa Cruz)或GHSR1a(1∶200，sc-10359，Santa Cruz)抗體孵育(24 h，4℃)，加入FITC交聯的兔抗羊IgG(1∶100，sc-2777，Santa Cruz)，置于黑暗濕盒內孵育2 h，甘油/PBS封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察免疫陽性細胞或熒光金分布。以正常羊血清代替Ⅰ抗做為陰性對照，其它步驟同上。

6 電刺激弓狀核和電損毀三角隔核

參照Paxinos-Watson圖譜將刺激電極插入右側弓狀核(前囟后2.12～4.30 mm，正中線旁開0～0.7 mm，顱骨下9.8～10.3 mm)。刺激參數為波寬0.5 ms，強度20 μA，頻率50 Hz，持續10 s［8］。假電刺激只埋藏電極，不通電。

電損毀隔核用陽極直流電1 mA持續20 s［9］進行電解損毀。假電損毀組只埋藏電極，不通電。電損毀7 d后進行胃運動實驗。

7 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0和Prism 5.0統計學軟件進行數據處理。兩個獨立樣本組間均數比較用t檢驗，多組間均數差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 隔核GHS-R1a受體的表達

熒光免疫組化研究顯示，在正常和DM大鼠隔核中均有GHS-R1a免疫陽性細胞表達，但DM大鼠隔核內GHS-R1a表達明顯降低［(10.0±2.1)/mm2vs(3.0±0.7)/mm2，P＜0.05］，見圖1A。

Real-time PCR結果顯示，DM大鼠隔核內GHSR1a mRNA表達循環閾值的循環次數較對照組大鼠明顯增加［(9.22±2.45)vs(14.11±4.01)］，mRNA含量約為對照組大鼠的(42.1±11.0)%(P＜0.05)，見圖1B。上述結果提示，DM大鼠隔核內GHS-R1a表達降低。

2 隔核注射ghrelin對DM大鼠胃運動的影響

與正常大鼠比較，DM大鼠胃運動明顯減弱，表現為胃收縮幅度［(7.21±2.47)g/min vs(4.03± 1.24)g/min，P＜0.05］和胃收縮頻率［(4.99± 0.87)Hz vs(3.02±0.21)Hz，P＜0.05，見圖2C、D］顯著降低，變化率分別為(55.89±5.70)%和(60.52±10.20)%，見圖2。結果提示，空腹DM大鼠胃運動能力降低。

Figure 1.The protein(A)and mRNA(B)expression of ghrelin receptor GHS-R1a in septal nucleus of normal and DM rats.LSD:lateral septal nucleus，dorsal part;LSI:lateral septal nucleus，intermediate part;LSV:lateral septal nucleus，ventral part.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs normal.圖1 正常和糖尿病大鼠外側隔核ghrelin受體GHS-R1a蛋白和mRNA表達的變化

Figure 2.The gastric motility of normal rats and DM rats.A: gastric motility traces;B:comparison of amplitude of gastric motility;C:comparison of frequency of gastric motility.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs normal.圖2 正常大鼠和糖尿病大鼠胃運動

正常大鼠隔核注射不同劑量ghrelin(0.05、0.5和5 nmol/L)，胃運動在注射后5～10 min開始增加，10～15 min內變化最為明顯，MI變化率分別為(50.99±15.31)%、(72.46±17.08)%和(88.74± 21.32)%(P＜0.05或P＜0.01)，見圖3A，且呈顯著量效依賴關系。給予ghrelin受體阻斷劑［D-Lys-3］-GHRP-6+ghrelin混合液，胃運動加強作用不再出現(P＞0.05)，見圖3A。在DM大鼠，隔核微量注射0.05 nmol/L ghrelin，胃運動MI有增加趨勢，但與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖3B;而注射0.5 nmol/L和5 nmol/L ghrelin，大鼠胃運動顯著增強，胃運動MI明顯增加，注射后10～15 min時變化率分別為(55.67±16.50)%和(71.41±21.50)%(均P＜0.05)，見圖3B。給予［D-Lys-3］-GHRP-6+ghrelin混合液，ghrelin促進胃運動增加作用消失(P＞0.05)，見圖3B。結果提示，在正常大鼠，隔核注射ghrelin對胃運動的促進作用強于DM大鼠，可能與DM大鼠隔核內GHS-R1a表達降低有關。

Figure 3.The effect of injection of ghrelin into septal nucleus on the gastric motility of normal rats(A)and DM ats (B).Mean±SD.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NS.圖3 隔核注射ghrelin對胃運動的影響

3 隔核-下丘腦弓狀核ghrelin通路構成及其對胃運動的調控

3.1 隔核-下丘腦弓狀核ghrelin通路構成 隔核微量注射熒光金，大鼠術后7 d灌注固定、取腦、切片，并進行ghrelin免疫熒光染色。在318 nm激發波長下，熒光顯微鏡下可見弓狀核中有大量胞體呈黃色光的神經元，即為熒光金標記神經元(圖4A)。在490 nm激發波長下，可見隔核內有ghrelin免疫陽性神經元表達(圖4B)，且部分ghrelin與熒光金標記的神經元共存(圖4C)，提示弓狀核有ghrelin免疫陽性神經元投射至隔核。

Figure 4.The expression of fluorogold-and ghrelin-positive neurons in the arcuate nucleus(ARC)of rats.A:fluorogold-positive neurons;B:ghrelin-positive neurons;C:fluorogold/ghrelin double-labled neurons.3V:the third ventricle of cerebrum.圖4 大鼠弓狀核熒光金與ghrelin免疫陽性神經元的表達

3.2 電損毀隔核對DM大鼠胃運動的影響 正常大鼠隔核損毀后胃運動變化率為(-10.23± 2.12)%，與假損毀大鼠［(2.01±0.77)%］相比無顯著差異(P＞0.05);在DM大鼠，隔核損毀后胃運動變化率［(-35.28±12.51)%］較假損毀DM大鼠［(5.18±1.44)%］顯著下降(P＜0.05)，見圖5A。結果提示，隔核參與DM大鼠對胃運動的調控。

3.3 隔核-下丘腦弓狀核通路對胃運動的調控隔核在正常和DM大鼠體內對胃運動的作用程度不同，隔核-下丘腦弓狀核通路是否參與此過程?為此本實驗進一步損毀隔核，觀察正常和DM大鼠電刺激弓狀核后胃運動的變化。如圖5B顯示，正常大鼠電刺激弓狀核后5～10 min胃運動變化率最大［(105.20±25.80)%］，與假電刺激對照組［(5.62 ±2.18)%］比較顯著增高(P＜0.05);大鼠在三角隔核電損毀術后7 d，電刺激弓狀核后5～10 min胃運動變化率為(96.52±31.12)%，與假損傷+電刺激對照組［(111.62±27.88)%］比較無明顯差異(P＞0.05)。在DM大鼠，電刺激弓狀核后5～10 min，與假電刺激對照組比較，胃運動顯著增強［(88.65±23.14)%vs(8.35±3.39)%，P＜0.05］;電損毀三角隔核術后7 d，電刺激弓狀核仍可導致胃運動明顯增強［(43.98±10.14)%vs(-5.26± 2.01)%，P＜0.05］，但較假損毀隔核+電刺激組明顯減弱［(43.98±10.14)%vs(82.31±22.91)%，P＜0.05］，見圖5C。結果提示，隔核-下丘腦弓狀核通路參與DM大鼠胃運動調控。

3.4 Ghrelin受體阻斷劑［D-Lys-3］-GHRP-6對隔核-下丘腦弓狀核通路作用 正常大鼠隔核內微量注射1 nmol［D-Lys-3］-GHRP-6，電刺激弓狀核大鼠胃運動最大變化率與隔核注射NS+電刺激弓狀核對照組比較無顯著差異［(98.57±19.22)% vs (108.38±29.25)%，P＞0.05］，見圖5B。在DM大鼠，隔核注射［D-Lys-3］-GHRP-6后電刺激弓狀核，胃運動顯著增強，最大變化率為(56.48±13.87)%，但明顯低于NS+電刺激弓狀核對照組［(96.57± 15.62)%，P＜0.05］，見圖5C。結果提示，在DM大鼠，弓狀核可能通過直接或間接釋放ghrelin至隔核，參與胃運動調控。

3.5 DM大鼠下丘腦促胃動激素表達變化 結果如圖6所示，DM大鼠下丘腦 ghrelin mRNA和 NPY mRNA均顯著高于正常大鼠(均P＜0.05)，但食欲素mRNA表達無顯著變化(P＞0.05)。該結果進一步證實，下丘腦ghrelin和NPY可能參與DM大鼠胃動力障礙的調控。

Figure 5.The effect of septal-arcuate(Arc)pathway on the gastric motility of DM rats.A:lesion of septal nucleus (SN)decreased the gastric MI%of DM rats;B:SN lesion did not affect the gastric MI%of normal rats; C:SN lesion weakened the increased gastric MI%by Arc electrical stimulation(ES)in DM rats.Mean± SD.n=8.*P＜0.05 vs sham lesion;#P＜0.05 vs sham lesion+Arc ES.圖5 隔核-弓狀核通路對DM大鼠胃運動的影響

Figure 6.The changes of mRNA expression of ghrelin，neuropeptide Y(NPY)and orexin in the hypothalamus of DM rats.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs normal.圖6 DM大鼠下丘腦ghrelin、NPY和食欲素mRNA表達變化

討論

糖尿病人多并發胃運動障礙，嚴重者可出現DGP，對此的研究多集中于胃腸道改變和促胃動力藥的外周作用研究［1］，而本實驗則主要研究中樞對胃腸運動調控，應用熒光免疫組化和real-time PCR檢測發現DM大鼠隔核內GHS-R1a表達顯著下降(圖1)，同時DM大鼠胃運動功能減弱(圖2)，提示糖尿病大鼠胃輕癱可能與隔核中GHS-R1a表達減少有關，Yang等［10］發現GHS-R基因敲除大鼠胃排空延遲，胃壁肌層內神經細胞數量減少。這些進一步說明GHS-R1a及其配體ghrelin可能在糖尿病胃輕癱發病中發揮重要作用。

Ghrelin作為GHS-Rla體內的天然配體由Kojima等［11］在1999年發現，包含28個氨基酸，分子量約為3.3kD。Ghrelin廣泛分布于體內多種組織器官，如大小腸、胰腺、腎臟、肝臟、垂體、下丘腦及海馬等［12-14］。第三腦室內注射ghrelin可增加大鼠攝食和胃運動增強［15］，而ghrelin信號通路受損后胃腸道運動功能明顯下降，并容易發生胃食管返流癥［16］。本實驗在隔核中注射微量ghrelin后正常大鼠和DM大鼠胃運動幅度都明顯增加，且呈劑量依賴性(圖3)，DM大鼠增加幅度低于正常大鼠。這表明隔核在注射ghrelin后經過某種途徑可引起胃運動增加，DM大鼠隔核對ghrelin反應性低于正常大鼠。

機體營養代謝狀態可通過外周血液營養成分、激素或迷走神經等發送信息至腦干，以調節各腦區的功能活動。因此，胃腸道、腦干、下丘腦和邊緣系統相互作用，構成一個復雜的網絡，共同調節攝食，隔核作為邊緣系統的一部分，在攝食與能量平衡調節中也發揮一定的作用。Scopinho等報道，外側隔核給予去甲腎上腺素增加大鼠攝食量，且α1受體拮抗劑WB4101顯著減弱此作用。這提示我們，外側隔核可能與攝食相關的獎賞行為有關。盡管大量的研究結果表明ghrelin與能量驅動的消耗有關，也有一些證據提示 ghrelin可能參與攝食的獎賞機制。GHS-R配體直接注射至腹側被蓋可引起大鼠強烈的進食反應，提示ghrelin通過中腦邊緣系統的獎賞通路可引發攝食［18］。這些研究提示，隔核ghrelin對胃運動的調控作用可能也與攝食相關的獎賞機制有關，但有待進一步研究。

隔核又稱隔復合體，位于側腦室的內側，胼胝體下方，左右兩側在中線上合并。按位置可將隔核分為背內側核群(內側隔核和斜角帶核)、腹外側核群(外側隔核)、背側核群(終紋床核)及尾側核群(隔海馬傘核和三角隔核)。作為Papez環路和基底外側邊緣環路的共有區域，隔核在情緒與動機的產生學習記憶的形成與鞏固、睡眠和覺醒中發揮重要作用，對心血管和胃腸道等內臟活動也具有明顯的調節作用［19-20］。近年發現，隔核與海馬、下丘腦、杏仁核、松果體、中腦、扣帶回、嗅球和丘腦存在廣泛的傳入和膽堿能傳出神經纖維聯系，參與多種生理功能的調控。例如，從內側隔核投射到海馬的γ-氨基丁酸能和膽堿能纖維通路參與學習與記憶過程［21］;相反，外側隔核主要投射到下丘腦和中腦區域，從而參與社會活動、焦慮、恐懼及與邊緣系統獎賞通路相關的行為活動［22-24］。外側隔核還接受來自海馬和杏仁核的大量谷氨酸能纖維傳入，與一系列記憶相關活動有關［25］。

本研究也進一步證實，在弓狀核內有ghrelin免疫陽性神經元存在(圖4)。同時還發現，在弓狀核向隔核的神經通路上有ghrelin陽性神經元的投射(圖4)，從而建立了下丘腦弓狀核-隔核ghrelin能神經通路。腦對攝食的調控分為兩部分:穩態調節和附屬調節［26］。穩態調節主要由下丘腦負責;附屬調節則是由邊緣系統，特別是海馬、杏仁核等核團完成，以便對環境條件和刺激如記憶、壓力、情緒、獎賞和快感等做出合適的反應。此通路的發現進一步驗證了中樞內攝食調控網絡的復雜性和多樣性。

弓狀核-隔核間ghrelin通路功能研究發現，電刺激損毀隔核后正常大鼠胃運動無明顯變化，而DM大鼠胃運動明顯減弱(圖5)，表明DM大鼠胃運動的調控不同于正常大鼠，并推測可能與隔核在DM大鼠胃運動調控中的功能強化或DM大鼠中樞神經系統各核團間平衡代償能力下降有關。正常大鼠電刺激損毀隔核或隔核內注射ghrelin受體抑制劑對電刺激弓狀核引起的胃運動變化無明顯作用，而DM大鼠則會出現明顯減弱(圖5)。DM大鼠胃平滑肌細胞反應［3］、自主神經功能［4］、平滑肌能量代謝方式［5］等方面都發生明顯變化，但本實驗首次通過觀察中樞神經系統內核團和通路變化對DM大鼠胃腸運動變化的影響，提出高血糖引發中樞系統內遞質及受體分布改變引發中樞性胃腸運動變化，為將來糖尿病胃輕癱中樞和外周合并治療提供理論基礎。

本實驗中ghrelin受體GHS-R1a在DM大鼠下丘腦中表達減少，前期實驗發現［27］，DM大鼠下丘腦弓狀核內GHS-R1a減少，表明DM大鼠下丘腦多個核團中GHS-R1a均表達減少，這可能引起中樞內ghrelin代償性分泌增多。另外，實驗結果顯示在應用GHS-R1a阻斷劑時胃運動減弱顯著，同樣情況下正常大鼠胃腸道運動無明顯變化。正常大鼠ghrelin、食欲素和NPY等多種激素同時參與胃腸運動調控，保持胃腸功能的“穩態”;而DM時胰島素分泌紊亂，機體代償功能失調，其它相關激素也必然受到影響，并且DM早期的“多食”癥狀，進一步刺激各種促胃動素分泌變化。

我們進一步對ghrelin、NPY和食欲素等的mRNA在下丘腦內的表達變化進行分析，發現ghrelin mRNA表達在DM大鼠下丘腦中表達明顯增多，NPY表達也輕度增加，食欲素表達無明顯改變。Gelling等［28］的研究也表明DM大鼠ghrelin濃度升高，且腦室注射后可顯著促進DM大鼠攝食，說明ghrelin在DM大鼠體重、攝食等的調控中發揮更重要的作用，這與本實驗結果一致。NPY mRNA表達同時增加，Lee等［29］曾通過針刺足三里以降低DM大鼠下丘腦中NPY以嘗試調控攝食和控制血糖，NPY/AGRP神經元通路作為眾多神經肽的作用位點，在DM時攝食和胃腸道的調控中更多是作為非特異性的通路。食欲素在正常大鼠體內參與調控能量平衡、睡眠周期和情緒學習等，Cai等［30］研究發現在肥胖大鼠中食欲素變化顯著，但在DM大鼠體內無明顯不同。本實驗中DM大鼠下丘腦內食欲素mRNA表達無顯著變化，與其研究結果相同。但Adeghate等［31］發現DM大鼠胰腺內食欲素受體增加，從而參與血糖的調控，提示食欲素也可能通過受體變化從而在DM大鼠中樞神經系統中發揮作用。

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Effect of ghrelin in septal nucleus on gastric motility of diabetic gastroparesis rats and its potential mechanism regulated by hypothalamic arcuate nucleus

YAN Chang-hong1，2，XU Luo1，GAO Sheng-li1，GUO Fei-fei1，SUN Xiang-rong1，GONG Yan-ling3
(1Department of Pathophysiology，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，China;2Heze Medical College，Heze 274000，China;3College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China.E-mail:xu.luo@163.com)

AIM:To study the effect of ghrelin in septal nucleus on the gastric motility of the rats with diabetes mellitus(DM)and to investigate the regulation of ghrelin pathway between arcuate and septal nucleus nuclei on gastric motility.METHODS:Streptozotocin was injected intraperitoneally to establish a DM rat model.Fluorescence immunohistochemistry and real-time PCR were used to detect the expression of ghrelin receptor GHS-R1a.The gastric motility was evaluated by implantation of a force transducer on the surface of rats＇stomachs and the motility index was also calculated.The neural connections between arcuate and septal nuclei were analyzed by the technique of fluorogold tracing.The neural control pathway of gastric motility was determined by central drug injection，nucleus lesion or nucleus electrical stimulation.RESULTS:The expression of GHS-R1a in the septal nucleus of DM rats was lower than that in normal rats(P＜0.05).The amplitude and frequency of gastric motility in the DM rats were lower than those in the normal rats(P＜0.05).The gastric motility of normal and DM rats were increased by injection of ghrelin into the septal nucleus in a dose-dependent manner.Seven days after injection of fluorogold into the septal nucleus，some neurons in arcuate nucleus were labeled by fluorogold and part of the labeled neurons were ghrelin immunopositive.No effect of nucleus lesion or nucleus electrical stimulation on the gastric motility in the normal rats was observed.In DM rats，the lesion of septal nucleus decreased the gastric motility(P＜0.05).In the normal rats，the change of gastric motility caused by electrical stimulation in arcuate nucleus was not affected by the lesion of septal nucleus(P＞0.05)，while the change was attenuated in DM rats(P＜0.05).The ghrelin receptor antagonist［D-Lys-3］-GHRP-6 had no significant effect on the gastric motility induced by electrical stimulation in arcuate nucleus of the normal rats(P＞0.05)，but it reduced the change in the DM rats(P＜0.05).CONCLUSION:Ghrelin in septal nucleus and the ghrelinergic pathway between arcuate and septal nuclei play an important role in the modulation of gastric motility in DM rats.

Diabetes Mellitus;Septal nuclei;Hypothalamus;Gastric motility;Ghrelin

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.018

1000-4718(2014)03-0486-08

2013-10-21

2014-02-12

國家自然科學基金資助項目(No.30670780;No.31071014;No.81100260;No.81270460;No.81300281);山東省科技攻關項目(No.2008GG10002006);山東省衛生廳項目(No.2007HZ026);青島市科技局項目(No.11-2-3-3-(2)-nsh;No.13-1-4-170-jch)

△通訊作者Tel:0532-82991713;E-mail:xu.luo@163.com