人參皂苷Rg1抑制叔丁基過氧化氫誘導的原代大鼠皮層神經元損傷*

逯 丹， 舒曉明， 張嬋娟， 趙佳儀， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥

(暨南大學醫學院病理生理學系，暨南大學腦科學研究所，國家中醫藥管理局重點科研實驗室，廣東廣州 510632)

人參皂苷Rg1抑制叔丁基過氧化氫誘導的原代大鼠皮層神經元損傷*

逯 丹▲， 舒曉明▲， 張嬋娟， 趙佳儀， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥△

(暨南大學醫學院病理生理學系，暨南大學腦科學研究所，國家中醫藥管理局重點科研實驗室，廣東廣州 510632)

目的：觀察人參皂苷Rg1對叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導的原代大鼠皮層神經元損傷的改善作用，并探討其可能機制。方法：將神經元隨機分為正常對照組、10 μmol/L t-BHP組及10 μmol/L t-BHP+10 μmol/ L人參皂苷Rg1組，培養24 h。采用MTT檢測不同濃度t-BHP處理的神經元活性，神經元三維重建研究神經元平均總纖維長度及總突起數量，免疫熒光檢測caspase-3表達水平及免疫印跡方法檢測Bcl-2、caspase-3以及磷酸化糖原合成酶激酶3β(pGSK-3β)蛋白表達水平。結果：10 μmol/L人參皂苷Rg1能夠對抗10 μmol/L t-BHP引起的原代大鼠皮層神經元活性水平的降低，并且上調Bcl-2及pGSK-3β蛋白表達量，降低caspase-3活化為cleaved caspase-3的水平(P＜0.05)。結論：人參皂苷Rg1可能通過提高GSK-3β自身磷酸化從而增強神經元的抗t-BHP損傷能力。

人參皂苷Rg1;叔丁基過氧化氫;糖原合成酶激酶3β

人參是祖國傳統中藥的珍品，含有多種有效成分，具有延年益壽滋補強身的功效。研究證實人參有效成分對動物的學習記憶功能有改善作用，且人參皂苷Rg1具有促智作用，可以顯著改善腦缺血及淀粉樣多肽等損害引起的學習記憶功能障礙，并對多種模型的學習記憶功能有保護作用［1］。人參皂苷Rg1作為人參藥理作用的主要成分之一，能夠提高機體內抗脂質過氧化體系活性從而延緩衰老，長期使用人參皂苷治療能防止老年小鼠失憶癥的發生，可改善記憶全過程［2］，人參皂苷Rg1作為益智藥的主要有效成分能夠促進神經遞質乙酰膽堿的釋放［3］、阻止腦內脂質過氧化過程［4］等。本研究以叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)誘導建立原代神經無損傷模型，觀察人參皂苷Rg1處理對t-BHP作用后細胞生長的影響以及神經突起變化，并對其機制進行初探。

材料和方法

1 動物

新生24 h內健康Sprague-Dawley大鼠乳鼠，SPF級，雌雄不限，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為4402101947。

2 主要試劑

人參皂苷Rg1(純度≥96%)購自廣東省藥品檢驗所。DMEM/F12試劑培養基購自HyClone。Neurobasal購自Invitrogen。B27購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone。胰蛋白酶、左旋多聚賴氨酸和MTT購自Sigma。Caspase-3抗體、磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，pGSK-3β)抗體和Bcl-2抗體均購自Cell Signaling Technology。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。大鼠神經元特異性微管相關蛋白2(microtubuleassociated protein 2，MAP-2)抗體購自 Millipore。TRICT標記山羊抗兔抗體以及FITC標記的驢抗兔抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 原代大鼠皮層神經元的的分離培養 用乙醇消毒新生鼠頭部后，斷頭處死，無菌條件下打開顱腔，于PBS磷酸鹽緩沖液分離出皮層，去除腦膜和血管，稍靜置待組織沉入離心管底部，以上步驟均在4℃條件下進行，靜止2 min后棄去上清，向組織內加入0.125%胰蛋白酶，消化10 min后加入添加血清的培養基終止其消化，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打至無可見的組織塊，組織懸液移至15 mL離心管進行離心，離心5 min后棄去上清液，加入DMEM/ F12完全培養基(含10%FBS)用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打數次，將吹打重懸后的沉淀通過200目篩網過濾后，用臺盼藍染色計數，調整細胞密度為2× 107/L接種于培養板中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，接種4 h后的細胞用原代神經元Neurobasal完全培養基(含2%B27)全量換液。培養3 d后，原代神經元完全培養基全量換液。

3.2 MAP2免疫熒光染色鑒定神經元并顯示其神經纖維形態 棄去培養基，用PBS洗1遍。用4%多聚甲醛溶液室溫固定神經元20 min。PBS洗細胞2次。用0.1%Triton X-100室溫透化處理細胞10 min(24孔板每孔加入500 μL)。用0.1%BSA室溫封閉1 h。用封閉液中稀釋MAP-2 Ι抗至工作濃度，置于濕盒內，4℃冰箱孵育過夜。除去Ι抗，用PBS洗3次(每次5 min)。圖4A為TRICT標記的熒光Ⅱ抗臨用前用PBS稀釋至工作濃度，圖4 B為FITC標記的熒光Ⅱ抗濕盒內室溫孵育Ⅱ抗30 min。除去Ⅱ抗，用PBS洗細胞3次(每次5 min)，加入500 μL PBS覆蓋后鏡下觀察，神經纖維的三維重建通過Imaris software(BitPlane AG)檢測。

3.3 實驗分組 (1)正常對照組:不加任何處理因素;(2)模型組:加入10 μmol/L t-BHP作用于原代皮層神經元24 h;(3)人參皂苷Rg1保護處理組:加入10 μmol/L Rg1預保護4 h后再與10 μmol/L t-BHP共同作用于原代大鼠皮層神經元24 h。

3.4 MTT法測細胞活性 原代培養的皮層神經元接種于96孔培養板，每孔100 μL細胞懸液，待細胞生長5 d，用不同濃度t-BHP與人參皂苷Rg1對細胞處理，每組設5個復孔，24 h后，用磷酸鹽緩沖液現配成初始濃度5 g/L的溶液，每孔加入100 μL MTT與培養基混合液，上述配液及加液過程需避光操作，之后置培養箱中37℃孵育4 h，在預熱10 min的Bio-Rad酶標儀570 nm波長處進行吸光度(absorbance，A)測定。根據下列公式計算各組細胞活性:細胞活性 =(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組) × 100%，實驗重復3次。

3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 培養細胞鋪板6孔板，按照先前的實驗分組，加入不同的損傷及保護處理藥物后開始后續實驗。達到作用時間后，吸出培養液，用PBS洗2次，每孔加入胰酶1 mL，放入培養箱消化3 min。輕輕吹打細胞使之懸浮于消化液中，在操作中要輕柔并且迅速，然后加含有血清的DMEM培養基終止消化。待細胞消化完全后，分組標記，配平。將消化好的細胞放入離心機中，1 000 r/min離心×5 min。輕輕吸取上清，將不同組間加入loading buffer 200 μL。用槍頭吹打成單細胞懸液。然后在避光條件下加入PI及FITC染料各2 μL。避光反應15 min。輕輕吹打混勻后，上級檢測各組細胞凋亡率。

3.6 免疫細胞化學法檢測caspase-3的表達 棄去培養基，用PBS洗1遍。4%多聚甲醛固定細胞后，加過氧化氫甲醇溶液滅活內源性的過氧化物酶。正常山羊血清室溫孵育10 min后，加PBST(含0.5% Triton的PBS磷酸鹽緩沖液)稀釋caspase-3 Ι抗，抗體4℃孵育過夜。加TRICT標記山羊抗兔IgG作用1 h，Hoechst 33342染核10 min后，洗片封片3次，每次5 min，顯微鏡下觀察并攝片。

3.7 免疫印跡法檢測Bcl-2、pGSK-3β和caspase-3表達 處理后的各組棄培養液，用預冷的PBS清洗2次，每孔加入60 μL細胞裂解液，冰面上裂解20 min，14 000×g、4℃離心10 min，取上清，Bradford法通過BCA定量試劑盒進行蛋白定量(碧云天)。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉PVDF膜1 h后，分別加入相應Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)于4℃ 孵育過夜，分別用相應的抗兔或鼠Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL發光液發光顯色，X線底片曝光。β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照。實驗重復3次。

4 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 13.0軟件包分析，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義

結果

1 原代大鼠皮層神經元鑒定

新生大鼠皮質神經元采用無血清Neurobasal完全培養基(含2%B27)培養，以減少膠質細胞的影響。培養5 d后，采用MAP-2免疫熒光染色對神經元進行鑒定，見圖1，可見所培養的細胞80%以上都為神經元，純度較高，可用于后續實驗。

Figure 1.Neuron identification.Analysis of MAP-2 protein expression and Hoechst 33342 in primary rat cerebrocortical neurons by immuncytochemistry.圖1 原代大鼠皮層神經元鑒定

2 人參皂苷Rg1對由t-BHP誘導的原代神經元細胞損傷的活性影響

t-BHP對原代皮層神經元損傷有濃度依賴性，見圖2A;10 μmol/L G-Rg1組處理24 h神經元活性為95.24%，較模型組有顯著提高，見圖 2B(P＜0.05)，說明人參皂苷Rg1在對抗t-BHP誘導的原代皮層神經元細胞活性降低時具有較好的改善作用。

Figure 2.G-Rg1 inhibited t-BHP-induced decrease in the viability of primary rat cerebrocortical neurons.Cell viability was measured by MTT assay.A:effects of different concentrations of t-BHP on cell viability;B:effects of G-Rg1 on t-BHP-induced cell viability.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(0 μmol/L t-BHP);#P＜0.05 vs 10 μmol/L t-BHP alone.圖2 人參皂苷Rg1對t-BHP誘導的原代皮層神經元活性的影響

3 人參皂苷 Rg1對 t-BHP誘導的細胞凋亡及caspase-3和Bcl-2表達的影響

如圖3所示，Q3區為正常細胞，Q2區為晚期凋亡細胞，Q4區為早期凋亡細胞。t-BHP損傷組與正常對照組相比，細胞凋亡有增加。10 μmol/L人參皂苷Rg1干預組凋亡細胞較t-BHP損傷組有降低。各組細胞經過相應處理后，Hoechst 33324染色結果顯示正常對照組細胞核光滑，形態較均勻一致，基本上沒有核固縮及核斷裂。損傷組與正常對照組相比較，可以觀察到大量神經元細胞核體積明顯減小，有些細胞核形狀不規則，其中一些有染色質濃縮、核固縮現象，邊緣化等典型的凋亡形態特征，凋亡細胞率損傷組較對照組有顯著增加。而人參皂苷Rg1組凋亡細胞率與 t-BHP損傷組相比較顯著降低，通過熒光顯微鏡可以觀察到有些細胞核體積縮小，有少量的核固縮，細胞核光滑，規則，基本均勻一致，少有核碎裂。對應的t-BHP損傷組caspase-3平均每個視野達到60.6%，與正常對照組的14.6%比較，有顯著高表達;而人參皂苷Rg1處理后的caspase-3顯著降低至36.4%，且與Hoechst 33324染色定位一致，見圖4 A～C，提示人參皂苷Rg1抑制的細胞凋亡可能通過抑制caspase-3表達進行的。免疫印跡結果顯示，t-BHP損傷引起的原代皮層神經元Bcl-2下調與caspase-3活化，經人參皂苷Rg1處理的神經元Bcl-2表達量顯著升高，caspase-3活性顯著降低(P＜0.05)，見圖4D、E。

Figure 3.G-Rg1 reduced t-BHP-induced apoptosis in primary neurons.圖3 人參皂苷Rg1對t-BHP誘導的原代皮層神經元凋亡的影響

4 人參皂苷Rg1提高神經元突起的抗損傷能力

如圖5A所示，人參皂苷Rg1單獨作用的神經纖維長度為1 086.53 μm，與正常對照組的894.9 μm相比較有略微增長，雖然無顯著差異(P＞0.05)，但提示人參皂苷Rg1對神經元保護作用可能與其維持神經纖維生長有關。按實驗分組處理后，10 μmol/L t-BHP損傷后神經纖維長度(146.25 μm)較正常對照組(854.6 μm)有顯著損傷，而10 μmol/L t-BHP+ 10 μmol/L人參皂苷Rg1組的纖維總長度(354.35 μm)較 10 μmol/L t-BHP損傷后神經纖維長度(146.25 μm)有所延長(P＜0.05)，見圖5B～E。免疫印跡檢測顯示，10 μmol/L t-BHP+10 μmol/L人參皂苷Rg1組pGSK-3β蛋白較t-BHP單獨損傷組水平有增加(圖5E)，提示人參皂苷Rg1能夠通過pGSK-3β途徑穩定神經元纖維，從而抵抗t-BHP誘導的損傷。

討論

氧化損傷引起的過多神經元丟失與神經退行性疾病有密切關系［5］。大量實驗證實神經退行性疾病中，神經元丟失多是由于凋亡通路被激活后誘發凋亡所致［6］。其中Bcl-2家族蛋白質是線粒體凋亡途徑的主要調控因子，上調Bcl-2成為抑制神經退行性疾病的細胞凋亡相關藥物的一類重要靶標。凋亡通路中一個重要的半胱氨酸蛋白酶成員caspase-3一直被認為是凋亡發生的執行者，實驗證實caspase-3被抑制后細胞能夠抵抗來自多種損傷的凋亡［7-8］。同時，兩者是氧化損傷線粒體途徑的重要節點。人參皂苷Rg1在多種細胞中驗證能夠減少細胞凋亡，例如Aβ1-42引起的PC12凋亡、MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡等等［9-10］。本實驗用t-BHP建立原代皮層神經元的衰老損傷模型，神經元可呈現與凋亡有關的衰老的細胞特征:MTT法顯示細胞活性降低;免疫熒光顯示caspase-3活化細胞增多;Hoechst 33342染色顯示異常細胞核增多。而人參皂苷Rg1顯著減輕了以上的衰老變化。

Figure 4.Effects of G-Rg1 on the activation of caspase-3 and the expression of Bcl-2 in t-BHP-induced primary rat cerebrocortical neurons.A～C:the immunofluorescence images showed remarkable changes using antibodies against caspase-3.The arrowheads pointed to examples of apoptotic cells marked by high intensity of blue fluorescence and nuclear condensation.D and E:Western blotting showed the expression of Bcl-2，cleaved caspase-3 and caspase-3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(no treatment);#P＜0.05 vs t-BHP alone.圖4 人參皂苷Rg1對t-BHP誘導的海馬神經元caspase-3活化水平及Bcl-2蛋白表達的影響

Figure 5.Effect of G-Rg1 on the injuries of cerebrocortical neurons and pGSK-3β protein expression induced by t-BHP.A and B:neurons were treated with or without 10 μmol/L G-Rg1 for 24 h，and MAP-2 immunofluorescence staining was performed for quantitative analysis of total filament;C～E:neurons were treated with or without 10 μmol/L G-Rg1 and 10 μmol/L t-BHP，and their injuries were demonstrated using MAP-2 immunofluorescence staining;F:expression of pGSK-3β protein analyzed by Western blotting.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(no treatment);#P＜0.05 vs t-BHP alone.圖5 人參皂苷Rg1對t-BHP誘導的大腦皮層神經元損傷及p-GSK-3β蛋白表達的影響

長時程增強是學習網絡形成必不可少的神經系統活動，需要許多神經纖維被同時激活，神經元的纖維主要包括軸突樹突，因此神經纖維的抗損傷能力越強，則越有利于神經網絡的維持，而人參皂苷Rg1具有促進海馬神經發生、增強學習和記憶力、抗衰老、提高神經可塑性的作用［11］，學習記憶及神經可塑性方面的改善可能與其對神經纖維的影響有關，通過本實驗以光鏡觀察及三維重建檢測神經纖維長度及形態在模型組有明顯損傷，而人參皂苷Rg1作用組神經纖維長度及形態有顯著改善，證明人參皂苷Rg1對神經纖維生長有促進作用從而使神經系統網絡的建立、樹突軸突的成熟和穩定趨于完善。與生存有關的GSK-3蛋白主要有兩種亞型，即GSK-3α和GSK-3β，GSK-3β還能作用于眾多信號蛋白、結構蛋白和轉錄因子，調控糖原合成酶的活性，調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡，而且活化的GSK-3β誘導tau蛋白的過度磷酸化，神經纖維過度纏結，神經元丟失，突觸丟失，同時抑制GSK3β高表達能夠穩定細胞微管的結構［12］。文獻報道 pGSK-3β是抑制GSK-3β活化的調節方式，因此人參皂苷Rg1作用的神經元對抗t-BHP損傷與增加GSK-3β磷酸化有關。GSK3β本身能活化caspase-3，也可能是促使神經元細胞損傷(或凋亡)的一個重要機制［13-14］。本研究發現，人參皂苷Rg1組較t-BHP損傷組caspase-3蛋白活化的水平顯著降低，進一步說明人參皂苷Rg1能夠通過GSK-3β磷酸化升高而降低GSK-3β表達，從而抑制caspase-3的活化，達到抑制細胞凋亡的目的。另外，抑制GSK-3β，即磷酸化GSK-3β后，能夠激活蛋白酶B通路，最終使得Bcl-2上調，引起凋亡抵抗［15-16］。本研究亦發現，人參皂苷Rg1組較t-BHP損傷組Bcl-2蛋白水平顯著升高，細胞對抗t-BHP損傷的能力增強。

綜上所述，人參皂苷Rg1能夠通過磷酸化GSK-3β而抑制GSK-3β活性，從而在提高原代皮層神經元抗衰老和抗損傷方面具有重要的意義，但其作用途徑及機制比較復雜，尚待進一步研究。

［1］王巧云，吳峰階.人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織NOS活性及蛋白表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(12):2328-2332.

［2］Fang F，Chen X，Huang T，et al.Multi-faced neuroprotective effects of Ginseno-side Rg1 in an Alzheimer mouse model［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822(2):286-292.

［3］Wang Q，Sun LH，Jia W，et al.Comparison of ginsenosides Rg1 and Rb1 for their effects on improving scopolamine-induced learning and memory impairment in mice［J］.Phytother Res，2010，24(12):1748-1754.

［4］Zhang JT，Qu ZW，Liu Y，et al.Preliminary study on antiamnestic mechanism of ginsenoside Rg1 and Rb1［J］.Chin Med J(Engl)，1990，103(11):932-938.

［5］Li WZ，Li WP，Zhang W，et al.Protective effect of extract of Astragalus on learning and memory impairments and neurons＇apoptosis induced by glucocorticoids in 12-month-old male mice［J］.Anat Rec(Hoboken)，2011，294(6):1003-1014.

［6］Wines-Samuelson M，Schulte EC，Smith MJ，et al.Characterization of age-dependent and progressive cortical neuronal degeneration in presenilin conditional mutant mice［J］.PLoS One，2010，5(4):e10195.

［7］Fuentealba RA，Liu Q，Kanekiyo T，et al.Low density lipoprotein receptor-related protein 1 promotes anti-apoptotic signaling in neurons by activating Akt survival pathway［J］.J Biol Chem，2009，284(49):34045-34053.

［8］Gui C，Wang JA，He AN，et al.Heregulin protects mesenchymal stem cells from serum deprivation and hypoxia-induced apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，2007，305(1-2):171-178.

［9］Chang CS，Chang CL，Lai GH，et al.Reactive oxygen species scavenging activities in a chemiluminescence model and neuroprotection in rat pheochromocytoma cells by astaxanthin，beta-carotene， and canthaxanthin ［J］.Kaohsiung J Med Sci，2013，29(8):412-421.

［10］ Chen XC，Fang F，Zhu YG，et al.Protective effect of ginsenoside Rg1 on MPP+-induced apoptosis in SHSY5Y cells［J］.J Neural Transm，2003，110(8):835-845.

［11］Chu SF，Zhang JT.New achievements in ginseng research and its future prospects［J］.Chin J Integr Med，2009，15 (6):403-408.

［12］Zhao MR，Li D，Shimazu K，et al.Fibroblast growth factor receptor-1 is required for long-term potentiation，memory consolidation，and neurogenesis［J］.Biol Psychiatry，2007，62(5):381-390.

［13］Dewachter I，Ris L，Jaworski T，et al.GSK3beta，a centre-staged kinase in neuropsychiatric disorders，modulates long term memory by inhibitory phosphorylation at serine-9［J］.Neurobiol Dis，2009，35(2):193-200.

［14］Goold RG，Owen R，Gordon-Weeks PR.Glycogen synthase kinase 3beta phosphorylation of microtubule-associated protein 1B regulates the stability of microtubules in growth cones［J］.J Cell Sci，1999，112(Pt 19):3373-3384.

［15］Takashima A.GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer＇s disease［J］.J Alzheimers Dis，2006，9(3 Suppl):309-317.

［16］Pan JJ，Chang QS，Wang X，et al.Activation of Akt/ GSK3beta and Akt/Bcl-2 signaling pathways in nickeltransformed BEAS-2B cells［J］.Int J Oncol，2011，39 (5):1285-1294.

Ginsenoside Rg1 protects primary rat cerebrocortical neurons against t-BHP-induced damage in vitro

LU Dan，SHU Xiao-ming，ZHANG Chan-juan，ZHAO Jia-yi，ZHU Li-hong，QI Ren-bin，WANG Hua-dong，LU Da-xiang
(Department of Pathophysiology，Institute of Brain Research，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

AIM:To observe the effect of ginsenoside Rg1(G-Rg1)on tert-butyl hydroperioxideo(t-BHP)-induced injury in primary rat cerebrocortical neurons and their filaments.METHODS:Primary rat cerebrocortical neurons were randomly divided into normal group，10 μmol/L t-BHP induction group and 10 μmol/L t-BHP+10 μmol/L G-Rg1 treatment group.The MTT assay was used to detect the cell viability under various concentrations of t-BHP.3D cell reconstruction was performed to measure the filament length and number.The protein expression levels of Bcl-2，phosphorylated glycogen synthase kinase 3β(pGSK-3β)and caspase-3 were determined by the methods of immunofluorescence and Western blotting.RESULTS:G-Rg1 at concentration of 10 μmol/L reversed the decrease in cell viability，increased the protein expression level of Bcl-2 and pGSK-3β，and suppressed the activation of caspase-3 in t-BHP induction group(P＜0.05).CONCLUSION:G-Rg1 increases the anti-stress ability of the neurons by increasing the pGSK-3β phosphoylation under the condition of t-BHP exposure.

Ginsenoside Rg1;Tert-butyl hydroperioxide;Glycogen synthase kinase 3β

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.017

1000-4718(2014)03-0479-07

2013-12-23

2014-01-20

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2011CB707501);廣州市科技計劃項目重大專項(No.11BppZXaa2070006);國家自然科學基金資助項目(No.81371442)

△通訊作者Tel:020-85220004;E-mail:ldx@jnu.edu.cn

▲并列第1作者