吉非替尼通過增加Foxo3a活性抑制肺纖維化小鼠上皮-間質轉分化*

彭 婷， 杜海堅， 李 理， 李偉峰△， 黃文杰

(1南方醫科大學研究生學院，廣東廣州 510515;2廣州軍區廣州總醫院呼吸內科，廣東廣州 510010)

吉非替尼通過增加Foxo3a活性抑制肺纖維化小鼠上皮-間質轉分化*

彭 婷1，2， 杜海堅2， 李 理2， 李偉峰2△， 黃文杰2

(1南方醫科大學研究生學院，廣東廣州 510515;2廣州軍區廣州總醫院呼吸內科，廣東廣州 510010)

目的：研究吉非替尼對肺纖維化小鼠轉錄因子叉頭框蛋白O3a(Foxo3a)活性、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平及相關通路的影響，探討吉非替尼抑制肺上皮-間質轉分化的可能機制。方法：將30只SPF級雌性昆明小鼠隨機分為3組:對照組(生理鹽水氣管內霧化)、博來霉素組(博來霉素3 mg/kg溶于100 μL生理鹽水氣管內霧化)和吉非替尼處理組(博來霉素氣管內霧化后，每天吉非替尼20 mg/kg溶于100 μL生理鹽水灌胃)。實驗第14天收集樣本，將小鼠肺組織置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE與Masson染色;RT-PCR法檢測Foxo3a和α-SMA mRNA表達水平;Western blotting法檢測表皮生長因子受體(EGFR)、Akt、Foxo3a和α-SMA蛋白表達水平。結果：吉非替尼處理組小鼠肺組織病理損傷較博來霉素組明顯減輕，膠原沉積明顯減少，炎癥損傷評分及纖維化評分明顯下降(均P＜0.01)，Foxo3a mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05)，α-SMA mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)，總Foxo3a蛋白表達增加，但Foxo3a磷酸化水平顯著下降(P＜0.01)，胞核Foxo3a蛋白明顯增加(P＜0.05);同時，EGFR和Akt磷酸化水平也顯著下降(P＜0.01，P＜0.05)，上皮-間質轉分化標志蛋白α-SMA表達水平明顯降低(P＜0.05)。結論：吉非替尼抑制博來霉素誘導的肺纖維化，其機制可能與抑制EGFR/Akt通路活化、增強轉錄因子Foxo3a活性、從而抑制上皮-間質轉分化密切相關。

吉非替尼;叉頭框蛋白O3a;肺纖維化;博來霉素;上皮-間質轉分化

上皮-間質轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)重要的特征改變，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及其受體(EGF receptor，EGFR)在間質性肺疾病發生、發展中起關鍵作用［1］，是參與上皮-間質轉分化的重要因素［2-3］。前期本實驗室的研究發現表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)吉非替尼(gefitinib，Ge)能緩解博來霉素(bleomycin，BLM)誘導的小鼠肺纖維化，同時下調上皮-間質轉分化重要標志——α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，但具體通路及機制尚未闡明［4-5］。

近年研究表明，叉頭框蛋白(forkhead box protein，FOX)家族是調控上皮細胞間質轉分化的重要轉錄因子［6］，其重要成員叉頭框蛋白O3a(forkhead box protein O3a，Foxo3a)參與纖維化的發生發展［7-8］，而 EGFR/Akt通路可直接調節 Foxo3a活性［9］。于是，本研究建立博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型，觀察吉非替尼對EGFR/Akt通路、轉錄因子Foxo3a活性及α-SMA表達水平的影響，探討吉非替尼抑制肺纖維化中上皮-間質轉分化的可能機制。

材料和方法

1 動物

8周齡SPF級雌性昆明小鼠共30只，體重約28 g，廣東省醫學實驗動物中心提供。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。

2 主要試劑

博來霉素購自浙江海正藥業，吉非替尼購自美國阿斯利康公司;Masson染色試劑盒購自福州邁新生物技術公司;PrimeScript RT Master Mix購自寶生物工程有限公司，2×Taq Master Mix購自康為世紀生物科技有限公司;Foxo3a抗體購自江蘇碧云天公司，EGFR抗體、p-EGFR抗體、Akt抗體、p-Akt抗體和p-Foxo3a抗體均購自CST，α-SMA抗體和β-actin抗體購自武漢博士德公司，H2A抗體購自SAB;小鼠喉鏡、小鼠固定操作臺與MicroSprayerTM霧化器來自Penn-Century。所用引物由上海英駿生物技術有限公司根據設計合成。

3 主要方法

3.1 實驗設計 30只小鼠隨機分為對照組、BLM組和吉非替尼處理(BLM+Ge)組，每組10只。BLM組小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于操作臺，以動物喉鏡壓下小鼠舌根暴露聲門，將霧化器從聲門插入氣管霧化博來霉素溶液(3 mg/kg，100 μL)，對照組霧化等體積生理鹽水;BLM+Ge組小鼠霧化BLM后每天給予吉非替尼(20 mg/kg，100 μL)灌胃，對照組與BLM組予相同體積生理鹽水灌胃。實驗第14天收集標本待測。

3.2 肺組織病理改變 小鼠肺組織以10%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片，HE染色及Masson膠原染色，膠原染色操作嚴格按照Masson染色試劑盒(福州邁新生物技術公司)產品說明書進行。肺損傷程度評分參照Mikawa等［10］的方法、纖維化程度評分參照Ashcroft等［11］的方法進行。

3.3 RT-PCR檢測肺組織Foxo3a與α-SMA mRNA表達 按RNAiso Plus試劑盒說明書提取各組小鼠肺組織總RNA，紫外分光光度計定量后稀釋成同一濃度(500 mg/L)，進行RT-PCR反應。引物序列為: Foxo3a上游引物5’-CGGACAAACGGCTCACTTT-3’，下游引物5’-TCGGCTCTTGGTGTACTTG-3’;α-SMA上游引物5＇-ACCCAGATTATGTTTGAGACC-3’，下游引物5’-CCGTCAGGCAGTTCGTAG-3’;β-actin上游引物5’-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3’，下游引物5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3’。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 40 s，55℃40 s，72℃ 40 s，72℃ 10 min。以β-actin為基準進行相對定量。

3.4 Western blotting檢測肺組織EGFR、Akt、Foxo3a和α-SMA 分別提取各組小鼠肺組織總蛋白及胞漿、胞核蛋白，BCA法蛋白定量后，每份蛋白樣品取50 μg上樣進行SDS-PAGE后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉20 mL室溫封閉1.5 h。TBST洗膜后，總蛋白樣本分別加入 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、Foxo3a、p-Foxo3a、α-SMA和β-actin抗體，胞核蛋白樣本加入Foxo3a抗體和H2A抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標記的Ⅱ抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL發光試劑檢測蛋白印跡條帶，吸光度掃描儀掃描膠片，Gelpro32軟件分析結果。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，肺組織病理評分用Kruskal-Walis檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 肺組織病理改變

1.1 小鼠肺臟HE染色 對照組小鼠肺組織結構完整，肺泡壁薄，無明顯充血及細胞浸潤，見圖1A;BLM組小鼠肺組織大面積實變，肺泡間隔增厚，間隔內成纖維細胞增多，肺泡內出血，炎癥細胞浸潤，見圖1B; BLM+Ge組小鼠肺泡結構相對完整，少量炎癥細胞浸潤，見圖1C。BLM和BLM+Ge組小鼠肺組織病理評分分別為8.42±1.68和5.44±1.33，BLM+Ge組小鼠肺組織病理評分較BLM組降低，兩者均高于對照組(1.10±0.80)，其差異均有統計學意義(n= 5，P＜0.01)。

Figure 1.Pathological changes of lung tissue(HE staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.圖1 小鼠肺組織HE染色

1.2 小鼠肺臟Masson染色及纖維化病理評分 對照組肺組織結構完整清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤、膠原沉積，見圖2A;BLM組小鼠肺組織結構紊亂，肺間質可見滲出、炎癥細胞浸潤和大量藍色膠原沉積，見圖2B;BLM+Ge組小鼠氣道上皮下出現少量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔稍增厚，但結構基本完整，少量藍色膠原沉積，見圖2C。3組小鼠肺組織纖維化病理評分依次為1.46±0.88、8.44±1.80和5.54± 1.32。BLM組評分較對照組顯著增加(n=5，P＜0.01)，BLM+Ge組評分較對照組增加，但比BLM組降低(n=5，P＜0.01)。

Figure 2.Pathological changes of lung tissue(Masson staining，×200).A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.圖2 小鼠肺組織Masson染色

2 肺組織Foxo3a與α-SMA mRNA的表達水平

BLM組小鼠肺組織Foxo3a mRNA轉錄水平較對照組降低(P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織Foxo3a mRNA轉錄水平較纖維化組增加(P＜0.05)，見圖3。而BLM組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉錄水平較對照組增加(P＜0.05);BLM+Ge組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉錄水平較纖維化組降低(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.The RT-PCR analysis for Foxo3a mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.圖3 Foxo3a RT-PCR結果

Figure 4.The RT-PCR analysis for α-SMA mRNA expression in the lung.A:control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖4 α-SMA RT-PCR結果

3 肺組織EGFR、Akt、Foxo3a與α-SMA蛋白的表達水平

BLM組小鼠肺組織p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a明顯增加(均P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織p-EGFR、p-Akt和p-Foxo3a降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)，見圖 5。BLM 組小鼠肺組織總蛋白Foxo3a表達水平較對照組及吉非替尼組降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖5。BLM組小鼠肺組織胞核Foxo3a明顯降低，α-SMA明顯增加(均P＜0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織胞核Foxo3a明顯增高，α-SMA明顯降低(均P＜0.05)，見圖6。

Figure 5.Western blotting for total and phosphorylated protein expression of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung.A: control;B:bleomycin;C:bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05，##P＜0.01 vs B.圖5 Western blotting檢測磷酸化EGFR、Akt和Foxo3a蛋白的表達

討論

Figure 6.Western blotting for nuclear Foxo3a and total α-SMA protein in the lung.A:control;B:bleomycin;C: bleomycin plus gefitinib.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs A;#P＜0.05 vs B.圖6 Western blotting檢測肺組織胞核Foxo3a及α-SMA蛋白的表達

目前研究認為上皮細胞損傷后的修復失調是肺間質纖維化關鍵的病理改變［12-13］，且EGFR參與了上述過程［2-3］。EGFR信號不僅促進上皮細胞向間充質細胞分化，而且延長已轉分化的間充質細胞壽命，最終加劇纖維化程度［14］。前期本實驗室研究發現使用吉非替尼對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠灌胃后，肺組織EGFR活性顯著降低，EMT標志蛋白α-SMA表達減少，小鼠肺部纖維化病理改變明顯減輕，Masson染色示氣道下膠原沉積明顯減少［4-5］，提示抑制EGFR活性能夠減輕博來霉素誘導肺纖維化與下調EMT過程密切相關。

近年有研究表明FOX家族可參與纖維化EMT的相關基因調控［6］。FOX蛋白家族是一類DNA結合區具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，與機體發育、細胞免疫、物質代謝及癌癥發生相關。FOXO是FOX家族的一個亞群，具有磷酸化、泛素化、乙酰化等多種修飾方式，其中最主要的修飾方式為磷酸化和去磷酸化。胞核FOXO蛋白去磷酸化為活性形式，磷酸化的FOXO蛋白則失去活性，由胞核轉移至胞漿［15］。本研究發現吉非替尼干預后，博來霉素致肺纖維化小鼠轉錄因子Foxo3a mRNA表達水平增加，胞核Foxo3a蛋白表達增加，相應的磷酸化Foxo3a水平降低，提示吉非替尼可抑制胞漿p-Foxo3a，促進Foxo3a核轉位，上調胞核Foxo3a表達水平。同時我們還研究發現，吉非替尼干預后，EGFR和Akt磷酸化水平降低，說明吉非替尼使Foxo3a去磷酸化并入核，可能與抑制EGFR/Akt通路活化密切相關，此與Ganesan等［9］通過EGFR-TKI增加胞核Foxo3a活性致相關細胞因子IL-8表達降低的研究結果一致。

最近有研究表明Foxo3a失活能夠促進特發性肺纖維化患者成纖維細胞增殖，同時伴隨膠原聚合物的增加［7］，且Foxo3a在轉化生長因子β1誘導的上皮-間質轉分化相關基因表達調控中起重要作用［8］。本研究發現吉非替尼干預后纖維化程度明顯減輕，且代表上皮-間質轉化的關鍵指標α-SMA表達明顯減少，與肺組織細胞核中Foxo3a的活性變化相反，提示Foxo3a對肺纖維化上皮-間質轉分化起負調控作用。負調控機制在EMT中普遍存在，能夠降低EMT相關基因表達以維持機體穩態。

綜上所述，EGFR-TKI代表藥物吉非替尼通過中斷EGFR信號，下調EGFR/Akt通路活性，使Foxo3a進入細胞核，降低上皮-間質轉分化標志物α-SMA表達，提示Foxo3a由EGFR/Akt通路調節，在肺纖維化上皮-間質轉分化過程中起負調控作用。

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Gefitinib inhibitsepithelial-mesenchymaltransition by up-regulating Foxo3a expression in mice with bleomycin-induced lung fibrosis

PENG Ting1，2，DU Hai-jian2，LI Li，LI Wei-feng2，HUANG Wen-jie2
(1Postgraduate Institute of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Respiratory Medicine，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China.E-mail:lwf980622@126.com)

AIM:To identify the effect of gefitinib on the expression of forkhead box protein O3a(Foxo3a)，α-smooth muscle actin(α-SMA)and related signal pathway molecules in the mice with bleomycin-induced lung fibrosis and to investigate the inhibition mechanism of gefitinib on lung epithelial-mesenchymal transition.METHODS:Thirty Kunming female mice were randomly divided into 3 groups:control group(received normal saline intratracheally)，bleomycin group(received bleomycin intratracheally，3 mg/kg)，and bleomycin plus gefitinib group(received bleomycin intratracheally and gefitinib orally，20 mg/kg).All the mice were sacrificed 14 d after the treatments.Pulmonary histological changes were evaluated by hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining.The mRNA levels of Foxo3a and α-SMA in the lung tissues were detected by RT-PCR.Nuclear Foxo3a，α-SMA，and phosphorylation of EGFR，Akt and Foxo3a in the lung tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Gefitinib inhibited bleomycin-induced lung fibrosis and significantly decreased the scores of lung inflammation and fibrosis.Foxo3a mRNA expression and total Foxo3a protein expression were increased，while the phosphorylated Foxo3a was decreased.Nuclear Foxo3a was increased significantly.Meanwhile，phosphorylated EGFR and Akt were decreased.The level of α-SMA was observably increased.CONCLUSION:Gefitinib restores Foxo3a activity and reduces α-SMA expression by modulating EGFR/Akt activity，thus inhibiting bleomycin-induced lung fibrosis.

Gefitinib;Forkhead box protein O3a;Lung fibrosis;Bleomycin;Epithelial-mesenchymal transition

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.011

1000-4718(2014)03-0444-05

2013-11-01

2014-01-13

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011010000511);廣東省科技計劃項目(No.2010B031600122);廣東省自然科學基金資助項目(No.9151001002000014);吳階平醫學基金會臨床科研專項資助基金資助項目(No.320.6750.12330)

△通訊作者Tel:020-88653555;E-mail:lwf980622@126.com