徐丹蘋， 吳煥林

(廣東省中醫院心臟中心，廣東省中醫藥科學院，廣東廣州 510006)

參術冠心顆粒對心肌梗死大鼠冠脈微循環的影響*

徐丹蘋， 吳煥林△

(廣東省中醫院心臟中心，廣東省中醫藥科學院，廣東廣州 510006)

目的：探討參術冠心顆粒(SSGX)對大鼠心肌梗死(MI)模型冠脈微循環作用。方法：健康SPF級SD大鼠50只，隨機分成假手術(sham)組、MI組、SSGX高劑量、中劑量和低劑量治療組，每組10只。后4組結扎冠狀動脈建立MI大鼠模型，假手術組只穿線不進行結扎。造模3 d后超聲檢查淘汰不合格大鼠，藥物干預4周，測定4周后各組大鼠血清心肌損傷標志物、梗死區中小血管平均血管面密度(MVC值)、梗死邊緣區血小板內皮細胞黏附分子1(PECAM-1)和血管內皮生長因子(VEGF)表達。結果：MI組與sham組比較，光學顯微鏡見MI組死亡的心肌纖維間空隙變寬，密集的中型多形核白細胞浸潤，肉芽組織增生，壞死心肌纖維被致密的膠原纖維取代。超聲可見MI組左室室璧活動異常，射血分數減低。心肌鈣蛋白T(cTnT)、MVC、PECAM-1和VEGF各指標與sham組比較均有顯著差異(P＜0.01)，證明造模成功。大鼠心肌梗死區中小血管的MVC、梗死邊緣區PECAM-1及VEGF的表達，SSGX各劑量組與MI組相比表達明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.01)，呈量效關系。但各SSGX組大鼠和MI組大鼠之間，心肌標志物差異無統計學意義(P＞0.05)。結論：參術冠心顆粒能改善心肌梗死大鼠冠脈微循環狀態，其機制可能與增加PECAM-1和VEGF表達、促進中小血管新生有關。

參術冠心顆粒;心肌梗死;冠脈循環

冠脈血運重建術的發展和成熟雖能重建心外膜的冠脈血流供應，但術后患者的反復心絞痛發作、進行性心功能惡化及冠脈無狹窄患者的客觀心肌缺血現象的存在，說明冠脈大血管血運重建并不代表心肌微血管的開放和心肌再灌注的成功，也不能完全解決冠脈微循環功能不全的問題。而冠脈微循環在心肌的血供中起著重要作用，其功能及結構的改變直接影響心臟的功能和代謝。

參術冠心方由七味中藥組成。既往臨床試驗表明，參術冠心顆粒(Shenshuguanxin granula，SSGX)可以降低冠心病心絞痛患者硝酸甘油的使用率，減少心絞痛發作次數，生存治療提高，改善心功能，改善活動耐量，降低血脂水平等，但對缺血心肌冠脈微循環的作用是否有改善并未明確。本研究擬觀察參術冠心方對冠狀動脈結扎心肌梗死(myocardial infarction，MI)大鼠模型的冠脈微循環狀態的影響，探討其對改善冠脈微循環可能的作用。

材料和方法

1 動物及分組

健康SPF級SD大鼠50只，體重200～220 g，雄性，由廣東省實驗動物中心提供。隨機分成正常對照組(假手術組)、心肌梗死組(模型組)、參術冠心顆粒高劑量治療組(高劑量治療組)、參術冠心顆粒中劑量治療組(中劑量治療組)和參術冠心顆粒低劑量治療組(低劑量治療組)，每組10只。

2 藥物制備

參術冠心顆粒，藥物組成:人參，蒼術等，由江陰制藥集團公司制備成復方顆粒劑成品，顆粒劑成品使用前用水稀釋成溶液，3 981.6 mg/kg為高劑量組，1 260 mg/kg為中劑量組，630 mg/kg為低劑量組。

3 模型制作

3.1 手術組(模型組、高劑量治療組、中劑量治療組、低劑量治療組) 固定動物，麻醉，接呼吸機，插管，開胸暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間可以看見左冠脈前降支起始部，距左心耳下緣0.1～0.2 mm處結扎冠狀動脈;觀察數分鐘，徹底止血后逐層關胸。術后肌內注射青霉素鈉2×105U/d，每天1次，連續3 d抗感染。

3.2 假手術組 僅在左心耳下緣與肺動脈圓錐間左冠脈前降支位置取同樣大小的針縫針而不打結，余操作與手術組同。

3.3 心臟彩超檢測造模效果，剔除不合格模型 術后第3天，氯烷吸入麻醉后，通過觀察左室心肌的搏動幅度，測量射血分數，剔除手術梗死不滿意的模型:梗死面積達不到左室面積30%～40%者剔除、梗死面積超過要求者剔除、發生嚴重心包積液剔除。

4 給藥

各組均予基礎飼料飼養。術后第3天開始，假手術組與模型組每日給予5 mL生理鹽水灌胃，低、中、高劑量組每天分別給予低、中、高劑量參術冠心顆粒(溶于5 mL注射用水)灌胃，連續4周。

5 血清心肌損傷標志物的測定

完成給藥后，開腹，暴露腹主動脈，取血3～4 mL，離心取上層血清測量心肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)的值。

6 梗死區中小血管平均血管面密度

取大鼠心臟左心室，4%多聚甲醛固定24 h，選取乳頭肌平面的最大橫面進行常規石蠟包埋、HE染色。用Motic B5顯微攝像系統200倍光鏡視野下心梗區隨機選取5個視野，用Image-Pro Plus醫學圖像分析系統分析，計數中小血管數(microvessel count，MVC)，取平均值，除以視野大小，以mm-2為單位表示微血管面密度。

7 梗死后大鼠梗死邊緣區微血管檢測——血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1)的免疫組化檢測

取梗死心肌與正常心肌的交界處切面，即乳頭肌平面外科手術結扎處，制作石蠟標本切片，然后以血管內皮細胞標志物PECAM-1抗體(Santa Cruz)進行免疫組化染色，檢測梗死邊緣區心肌中毛細血管再生。在高倍鏡下(200倍)隨機選取5個視野，采用Image-Pro Plus醫學圖像分析系統計算其IA值，也就是血管密度值，取均值。

8 梗死后大鼠梗死邊緣區血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的免疫組化檢測

取模型組及參術冠心顆粒高、中、低劑量組大鼠心肌標本，取梗死心肌與正常心肌的交界處切面，即乳頭肌平面外科手術結扎處，制作石蠟標本切片，然后以免疫組化法檢測梗死邊緣區大鼠心肌中VEGF (抗體購自Santa Cruz)表達。在高倍鏡下(200倍)隨機選取5個視野，采用Image-Pro Plus醫學圖像分析系統計算其IA值，取其平均值統計分析。

9 統計學處理

采用SPSS 13.0進行統計描述與統計推斷，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，統計推斷采用One-way ANOVA和LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 HE染色后光學顯微鏡下心肌觀察

取心臟平乳頭肌橫切面，行HE染色，假手術組可見心肌細胞排列均勻緊密;模型組可見(梗死4周后)死亡的心肌纖維間空隙變寬，密集的中型多形核白細胞浸潤，肉芽組織增生，壞死心肌纖維被致密的膠原纖維取代，殘留少數的心肌細胞，見圖1。

Figure 1.Myocardium with HE staining(×200).A:sham group;B:myocardial infarction(MI)group.圖1 假手術組與模型組心肌HE染色

2 假手術組與模型組動物超聲心動圖對比

動物超聲心動圖，模型組可見左室室璧活動異常，射血分數減低，假手術組無此現象，見圖2。

Figure 2.Representative M-mode echocardiograms of the left ventricle in the parasternal short-axis view.A:sham group;B:myocardial infarction(MI)group.圖2 假手術組和模型組心肌超聲心動圖對比

3 各組大鼠血清心肌損傷標志物的比較

假手術組與模型組的cTnT相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。假手術組與模型組CK、CK-MB、 LDH和AST差異沒有統計學意義(P＞0.05)。各手術組cTnT、CK、CK-MB、LDH和AST組間比較均無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 心肌損傷標志物樣本均數及標準差Table 1.Myocardial injury markers in serum of rats(Mean±SD)

4 各組梗死區域心肌中小血管平均密度值對比

在病理圖像分析系統下測定各組大鼠心肌梗死邊緣區平均血管面密度，見圖3。假手術組與模型組的梗死區域心肌中小血管平均密度值相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。其中，參術冠心顆粒高劑量組高于中劑量組和低劑量組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Density of small and medium vessels in myocardial infarction area(HE staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group or MI+SSGX at low dose group.圖3 梗死區域心肌中小血管平均密度值

5 各組大鼠梗死邊緣區心肌中微血管PECAM-1蛋白表達

假手術組與模型組的梗死交界處心肌中免疫組化PECAM-1蛋白表達量相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。各手術組梗死交界處心肌中免疫組化PECAM-1蛋白表達量比較:各給藥組也明顯高于模型組，差異均有統計學意義(P＜0.05);其中，高劑量＞中劑量＞低劑量，見圖4。

Figure 4.Expressin of PECAM-1 in the infarct border zone(immunohistochemical staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group;▲P＜0.05 vs MI+SSGX at low dose group.圖4 梗死交界區PECAM-1表達的免疫組化檢測

6 各組大鼠梗死邊緣區心肌中新生血管VEGF蛋白表達

假手術組與模型組的梗死交界處心肌中VEGF蛋白表達差異有統計學意義(P＜0.05)。參術冠心顆粒中、低劑量組與模型組比較無明顯差異(P＞0.05)，高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);其中，高劑量＞中劑量＞低劑量，差異均有統計學意義，見圖5。

Figure 5.Expressin of VEGF in the infarct border zone(immunohistochemical staining，×200).A:sham group(n=10);B:myocardial infarction(MI)group(n=10);C:MI+SSGX at high dose group(n=10);D:MI+SSGX at middle dose group (n=9);E:MI+SSGX at low dose group(n=9).*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs MI group;#P＜0.05 vs MI+ SSGX at middle dose group;▲P＜0.05 vs MI+SSGX at low dose group.圖5 梗死交界區免疫組化VEGF表達

討論

冠脈血運重建術的發展和成熟雖能重建心外膜的冠脈血流供應，大大降低冠心病尤其是急性心肌梗死患者的死亡率，但術后患者的反復心絞痛發作、進行性心功能惡化及冠脈無狹窄患者的客觀心肌缺血現象說明血運重建治療并不十分滿意。勞力性心絞痛是以大的冠狀動脈硬化性狹窄為病理基礎的，但微循環擴張功能可能參與修飾缺血的閾值。有研究觀察到在冠脈系統內給予內皮來源的NO前體L-arginine，可以預防冠脈狹窄患者由于心率增加而誘發的心肌缺血［1］。因此這些患者發生心肌缺血，不僅存在有大的冠狀動脈狹窄，同時也存在冠脈微循環血流調節的異常。

冠脈微循環是由微動脈、毛細血管和微靜脈構成的微循環系統，是心臟循環系統最末梢的部分，因其直徑較小而冠脈造影看不見。生理情況下，心肌血流量的變化主要由微血管的擴張或收縮來調節。大量研究表明冠脈微血管障礙多和心外膜冠脈病變同時存在，但也常常是一種單獨的疾病或狀態。所以，血運重建術后患者的反復心絞痛發作、進行性心功能惡化及冠脈無狹窄患者的客觀心肌缺血現象說明冠狀動脈微循環在心肌的血供中起著重要作用［2］。

微循環障礙的發生，使得已經開通狹窄血管所支配的心肌仍然達不到真正意思上的再灌注，心外膜大血管開通的部分病人生存率并未提高。因此，冠脈微循環改善是心肌存活及功能恢復的前提，是評價再灌注治療成功與否的關鍵所在。Gibson等［3］認為冠脈微循環的受損是決定急性心肌梗死的獨立危險因素。

參術冠心顆粒是根據國醫大師鄧鐵濤教授調脾護心法治療冠心病經驗總結開發的治療冠心病的中成藥，其有效成分包括人參、蒼術等傳統中藥材，臨床研究證實其能減少冠心病患者心絞痛的發作頻率和程度、改善生存質量［4-8］。

心肌細胞損傷后因膜的完整性和通透性改變，導致細胞內的大分子生物化學物質逸出，稱為心肌標志物。CK和CK-MB在MI后4～6 h即可超過正常上限，24 h達峰值，CK半衰期10～12 h，48～72 h就回落到正常范圍。本實驗研究結果提示，各組實驗組大鼠和對照組大鼠之前，肌鈣蛋白和心肌酶都沒有明顯差異。分析其原因，主要是實驗的采血時間，超過了各種心肌標志物在血清的半衰期，所以差異沒有統計學意義。

Yokoyama等［9］也發現，如果沒有小動脈再生，僅有毛細血管再生，對增加血液供應并無益處，有血流傳輸功能的小動脈再生是組織存活的前提。本研究結果提示，各組梗死區域心肌中小血管平均密度值對比，與假手術組相比，所有的手術模型心肌梗死區域都會出現不同程度的中小血管增多的表現，這與文獻報道的相符，即一旦出現心肌梗死，就會有血管增生的存在。各干預的組間比較:參術冠心顆粒高劑量組高于中劑量組和低劑量組。這說明參術冠心方表現出可以增加梗死區域心肌中小血管平均密度值的作用，且呈量效正相關。

PECAM-1是調控血管內皮細胞凋亡的重要調控因素。它是免疫球蛋白超家族細胞黏附因子中的一種，是參與血小板黏附和聚集的關鍵因子，有研究發現PECAM-1與臨床多種疾病尤其是心血管疾病的發生相關，如動脈粥樣硬化，血栓形成;也與多種炎癥因子相互作用而調節炎癥過程。PECAM-1可以抑制血管內皮細胞的凋亡，是血管內皮細胞的保護性機制之一［10］。由于在發育和成熟個體的所有血管內皮細胞均高度表達PECAM-1，所以PECAM-1常常被用來作為血管內皮細胞的標志物。PECAM-1與血管生成內皮細胞在形成新生血管時，首先發生細胞間接觸，增殖以后遷移到血管周圍基質，在此重新建立細胞聯系并形成新的血管腔［11］。本研究表明，各組大鼠梗死邊緣區心肌中微血管PECAM-1蛋白表達免疫組化的對比，各手術組IA值明顯高于假手術組，各給藥組也明顯高于模型組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。其中，參術冠心方高劑量＞中劑量＞低劑量，差異均有統計學意義。這證明參術冠心方對增加各組大鼠梗死邊緣區心肌中微血管有作用，參術組表現出明顯的劑量依賴性。

VEGF是內皮細胞特異性的促有絲分裂原，是一種分泌性的糖蛋白，能夠促進內皮祖細胞的動員、增殖，并對內皮母細胞具有趨化作用，可促進血管內膜修復及缺血組織的血管新生［12］。Dimmeler等［13］研究發現人正常心臟血管內沒有VEGF mRNA及其受體的表達，而在心肌梗死時，在壞死區附近小靜脈平滑肌細胞明顯高于心肌細胞。這就是我們在該研究中在梗死交界區測定VEGF蛋白表達的原因。關于側支循環的建立:在冠狀動脈狹窄的病人，缺血導致的冠狀動脈側支循環的建立，非常依賴于VEGF表達，建立側支循環與沒有建立側支循環的心肌比較，其缺氧產生的VEGF mRNA前者顯著高于后者，進一步說明心肌缺血時VEGF的高表達可促進側支循環的建立［14］。而側支循環的建立是修復梗死心肌、減少心肌梗死面積和維持心功能的重要條件。本研究顯示:各手術組VEGF蛋白表達IA值明顯高于假手術組，各給藥組中，低劑量組與模型組無明顯差異(P＞0.05)，其余給藥組與模型組差異均有統計學意義(P＜0.05)。其中，高劑量＞中劑量＞低劑量，差異均有統計學意義，說明參術冠心方具有促進血管新生，促進梗死后心臟側支循環形成的作用。

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Effect of Shenshuguanxin granula on coronary circulation in rats with myocardial infarction

XU Dan-ping，WU Huan-lin
(Heart Center，Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou 510006，China.E-mail:wuhuanlinboshi@aliyun.com)

AIM:To explore the effect of traditional Chinese medicine Shenshuguanxin granula on coronary circulation in a rat model of myocardial infarction(MI).METHODS:SD rats(n=50，SPF grade)were randomly divided into 5 groups(n=10):sham group，MI group，and high-dose，middle-dose and low-dose Shenshuguanxin granula treatment groups.The rat MI model was established by ligation of the coronary artery.The cardiac markers，small and medium-sized blood vessels［microvessel count(MVC)value］in the infarct zone，and platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM-1)and vascular endothelial growth factor(VEGF)expression in the infarct border zone were measured.RESULTS:After 4 weeks of coronary artery ligation，the significant increases in MVC in the infarct zone，and the expression of PECAM-1 and VEGF in the infarct border zone were detected compared with sham group(P＜0.05).The differences of cardiac markers between MI group and other groups were insignificant(P＞0.05).CONCLUSION:Shenshuguanxin granula improves coronary circulation in the rats with myocardial infarction by increasing the expression of PECAM-1 and VEGF，and promoting small and medium-sized angiogenesis.

Shenshuguanxin granula;Myocardial infarction;Coronary circulation

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.010

1000-4718(2014)03-0438-06

2013-12-04

2014-01-09

廣東省科學技術廳-廣東省中醫藥科學院聯合科研專項(No.2012A032500017)

△通訊作者Tel:020-87351238;E-mail:wuhuanlinboshi@aliyun.com