X線照射增加大鼠心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性*

王 潔， 陸克義， 周軍濤， 李險峰△

(山西醫科大學第一醫院1神經內科，2核醫學科，3放療科，山西太原 030001)

X線照射增加大鼠心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性*

王 潔1， 陸克義2， 周軍濤3， 李險峰3△

(山西醫科大學第一醫院1神經內科，2核醫學科，3放療科，山西太原 030001)

目的：觀察胸部X線放射治療大鼠對心肌缺血/再灌注損傷的敏感性。方法：用胸部單次照射X線20 Gy構建放射性心臟損傷模型，采用完全隨機分組方法將Wistar大鼠分為假損傷組、損傷組、假損傷+假手術組、假損傷+缺血/再灌注組、損傷+假手術組和損傷+缺血/再灌注組，于創傷后2周行心肌缺血/再灌注。通過BL-410生物信號記錄分析系統記錄各組大鼠左心室發展壓(LVDP)、左心室壓力上升的最大速率(+dp/dtmax)和左心室壓力下降的最大速率(-dp/dtmax);采用ELISA方法檢測大鼠血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB);用BI2000圖像分析軟件測定心肌梗死面積占總面積的百分比。結果：損傷+缺血/再灌注組離體心功能明顯低于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)，損傷+缺血/再灌注組血清cTnI和CK-MB水平顯著高于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)，損傷+缺血/再灌注組心肌梗死面積顯著大于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)。結論：X線照射增加大鼠心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性。

放射性心臟損傷;心肌缺血;再灌注損傷;敏感性

隨著三維適形、調強適形及圖像引導等精確放射治療技術的廣泛應用，胸部腫瘤患者的生存時間明顯延長［1］，而在放射治療過程中位于縱膈的心臟不可避免地要受到射線影響。已有臨床資料顯示這部分患者心血管疾病的發病率和死亡率都明顯高于對照人群;據統計，由放療所導致的放射性心臟損傷(radiation-induced heart disease，RIHD)已成為非腫瘤死亡的首要原因［2］。X線照射可導致繼發性心臟損傷，臨床表現為冠狀動脈疾病、心功能障礙，甚至出現充血性心力衰竭，從而抵消了腫瘤患者由放射治療產生的部分生存受益［3-4］。因此，在強調通過放射治療提高腫瘤患者生存率的同時，避免RIHD是提高這些患者療效和生存質量的重要保證。然而，RIHD是由于X線照射直接損傷所致還是放射治療后心臟組織對不良刺激(如缺血/再灌注損傷)的敏感性增高所致還不清楚。為此，本文通過研究放射治療后心肌組織對缺血/再灌注損傷的反應性，擬探討RIHD的可能機制，從而為臨床尋找放射治療所致RIHD的最佳預防及治療方案、進而降低死亡率提供直接的實驗基礎和理論依據。

材料和方法

1 動物、主要試劑和儀器

實驗動物的使用遵循《中華人民共和國衛生部令(第55號)-醫學實驗動物管理實施細則》，以及《山西醫科大學實驗動物管理細則》，并得到了山西醫科大學動物保護協會的批準。健康雄性Wistar大鼠72只，體重200～250 g，清潔級。心肌肌鈣蛋白I (cardiac troponin I，cTnI)測定試劑盒(Burlingame);肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)測定試劑盒(上海玉蘭生物技術研究所);硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT;Sigma);直線加速器(Varian IX);計算機生物信號采集分析系統(BL-410);小動物呼吸機(DH-150);注射用甲氧異腈［Cu (MIBI)4BF4］(北京師宏藥物研制中心);高锝［99Tcm］酸鈉注射液(原子高科股份有限公司); BHP6602小型γ相機(濱松光子股份有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠放射性心臟損傷模型的建立及分組 將大鼠按完全隨機分組方法分為 6組:假損傷組(sham)、損傷組(RIHD)、假損傷+假手術組(sham +NIR)、假損傷+缺血/再灌注組(sham+IR)、損傷+假手術組(RIHD+NIR)和損傷+缺血/再灌注組(RIHD+IR)，每組12只，6只用于離體心功能和血清學指標測定，6只用于心肌梗死面積測定。RIHD模型制備:10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定，行螺旋CT定位心臟，采用Varian IX直線加速器局部照射，采用前、后、左、右4個野照射，按生物效應劑量(biological effective dose，BED)公式將臨床常規分割照射劑量(80 Gy)換算為單次照射劑量約為20 Gy，單次照射源靶距100 mm。

2.2 心肌缺血/再灌注模型的制備 大鼠在X線照射后2周行心臟缺血/再灌注。Wistar大鼠經1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰臥位，于頸部至劍突去毛切開皮膚，鈍性分離氣管，連接麻醉呼吸機，開胸后進行輔助呼吸，吸氣∶呼氣比為1∶2。于胸骨左緣第一肋間開胸暴露心臟，輕壓擠出心臟，剪開心包膜，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主干為標志，用6/0號細線結扎左冠狀動脈前降支中上部，迅速將心臟放回胸腔。心肌缺血30 min后，松開結扎細線恢復血供，心肌再灌注3 h。術前、缺血后及再灌注后各記錄心電圖1次，以缺血后ST段抬高作為心肌缺血造模成功的標志。假手術組僅穿線而未結扎冠狀動脈。

2.3 Langendorff離體心臟灌流 猛擊大鼠后枕部致昏，迅速開胸取出心臟，放入預冷的Krebs-Henseleit液(K-H液)中，修剪后將主動脈懸掛于Langendorff灌流裝置上，用充以95%O2與5%CO2混合氣體的 K-H液灌流。K-H液的成分為:118 mmol/L NaCl，4.75 mmol/L KCl，1.19 mmol/L KH2PO4，1.19 mmol/L MgSO4·7H2O，2.54 mmol/L CaCl2·2H2O，25 mmol/L NaHCO3，0.5 mmol/L EDTA，11 mmol/L glucose(pH 7.4，37℃)。將起搏電極置于離體心臟右室，刺激強度設置為2倍閾強度，頻率為200 beats/min。將一乳膠水囊(直徑約3～5 mm)經左心房插入左心室內，水囊內充有一定量的灌流液，水囊導管另一端與壓力換能器相連，穩定15～20 min后采用BL-410生物信號記錄分析系統記錄大鼠左室發展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、左室壓力升高最大速率(+dp/dtmax)及左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)。

2.4 ［99Tcm］-MIBI制備與心肌顯像 取甲氧異腈凍干品1瓶，在無菌操作條件下，依高锝［99Tcm］酸鈉注射液的放射性濃度，取2～6 mL(370～3 700 MBq)注入瓶內，充分振搖，使凍干品溶解后立于沸水浴中直立加熱 10～15 min，取出冷卻至室溫，得到［99Tcm］-MIBI。取［99Tcm］-MIBI 18.5 MBq，經大鼠尾靜脈緩慢推注，30 min后采集前位平面顯像，采集儀器為BHP6602小型γ相機，探頭配置低能高分辨針孔準直器，能峰為140 keV，窗寬20%，矩陣256× 256×16，計數預置500K。應用感興趣區(regions of interest，ROI)技術勾畫心臟及上縱隔區域，得到其平均計數，應用心臟/縱隔比值半定量分析心臟的［99Tcm］-MIBI攝取值。

2.5 血清學指標檢測 各組大鼠于造模后3 h，麻醉狀態下從腹主動脈取血3 mL，將血液常溫靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液放入-20℃冰箱待測。參照試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定cTnI和CK-MB。

2.6 心肌梗死面積測定 采用硝基四氮唑藍染色法測定心肌梗死面積。缺血/再灌注后3 h，于麻醉下迅速取心臟，放入生理鹽水中沖洗，仔細去除左心室外其它部分(兩側心房、大靜脈及右心室)，-80℃凍存。取出-80℃凍存的心臟，垂直于左心室長軸方向，自心底向心尖將其切成厚度均勻的6片，放入1%的三羥甲基氨基甲烷溶液(pH 7.4)中，37℃水浴5～10 min。正常左室心肌染為暗藍色，梗死區心肌則不染色。用BI2000圖像分析軟件測定心肌梗死面積占總面積的百分比，即梗死面積百分比=心肌梗死面積之和/心肌總面積之和×100%。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計學軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 RIHD后2周大鼠心肌［99Tcm］-MIBI攝取的變化

RIHD后2周損傷組心肌［99Tcm］-MIBI攝取明顯減低(1.96±0.13 vs 1.68±0.19，P＜0.05)，這提示RIHD后2周大鼠心肌血流灌注及線粒體功能降低，見圖1。

Figure 1.Changes of［99Tcm］-MIBI uptake in the myocardium 2 weeks after RIHD.H:heart;M:upper mediastinum.A:sham;B:RIHD.圖1 RIHD后2周心肌［99Tcm］-MIBI攝取的變化

2 缺血/再灌注后大鼠離體心功能的變化

LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標在sham組、RIHD組、sham+NIR組及RIHD+NIR組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。這提示X射線損傷和(或)假手術不影響LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax的變化。sham+IR組LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax明顯低于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+IR組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯低于sham+IR組(P＜0.01)，見表1。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注大鼠LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低更明顯。

表1 各組大鼠心功能參數的比較Table 1.The parameters of cardiac functions in the rats with different treatments(Mean±SD.n=6)

3 缺血/再灌注后大鼠血清cTnI和CK-MB水平變化

RIHD+NIR組cTnI和CK-MB水平高于sham+ NIR組(P＜0.05);sham+IR組cTnI和CK-MB水平明顯高于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+IR組cTnI和CK-MB水平明顯高于sham+NIR組(P＜0.01)，見表2。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注術大鼠cTnI和CK-MB水平升高更顯著。

表2 各組血清cTnI和CK-MB的比較Table 2.The concentrations of cTnI and CK-MB in the rats with different treatments(μg/L.Mean±SD.n=6)

4 缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面積的影響

硝基四氮唑藍染色正常心肌為暗藍色，梗死區心肌為紅色。Sham+NIR組與RIHD組心肌梗死面積比較無顯著差異(P＞0.05);sham+IR組和RIHD +IR組明顯高于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+ IR組心肌梗死面積明顯高于 sham+IR組(P＜0.01)，見圖2。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注術心肌梗死面積明顯增大。

討論

Figure 2.The infarct volume of the myocardium in the rats with different treatments(NBT staining).A:sham+NIR; B:RIHD;C:sham+IR;D:RIHD+IR.Mean± SD.n=6.##P＜0.01 vs sham+NIR group;＊＊P＜0.01 vs sham+IR group.圖2 各組心肌梗死的NBT染色

胸部腫瘤發病率逐年上升，嚴重威脅人類的健康。放射治療在胸部腫瘤的治療中占有重要地位，而X線照射所導致的心血管疾病的發病率和死亡率都明顯高于對照人群［5］。因此，在強調通過放射治療提高腫瘤患者生存率的同時，避免RIHD是提高這些患者療效和生存質量的重要保證。胸部X射線照射首先損傷心臟的微循環系統，導致血管內皮功能和結構損傷，形成粥樣斑塊，繼而發生血管內腔狹窄或閉塞，出現微循環障礙而發生心肌缺血、缺氧，進而累及心肌細胞，引起心肌細胞死亡，并最終導致心功能損傷［5］，在臨床上可表現為冠心病、急性心衰等。

本實驗參照Kuse等［6］提出的RIHD模型制備方法，給予實驗大鼠心臟單次局部照射劑量20 Gy，采用［99Tcm］-MIBI心肌顯像來評價心肌的血流量和線粒體功能。［99Tcm］-MIBI是臨床上早期診斷冠心病、心肌缺血的常用檢查方法［7-8］，當線粒體膜電位正常時，［99Tcm］-MIBI可通過被動擴散進入線粒體膜，而當線粒體膜電位下降時，心肌對［99Tcm］-MIBI攝取障礙。由于在整體情況下，機體會通過神經體液調節維持重要器官功能的穩定性，為排除神經體液的影響，我們檢測了創傷后大鼠的離體心功能，其能客觀反映損傷后心臟早期的實際變化，常用LVDP及±dp/dtmax等指標來衡量左室收縮功能，其中+dp/ dtmax反映心肌纖維收縮性能的改變;-dp/dtmax是反映心肌舒張性能的指標。結果發現2周后大鼠心臟出現線粒體功能損傷，而心臟離體心功能的未出現異常。

RIHD常處于亞臨床狀態，經過相當長的潛伏期才出現臨床癥狀，多在放射治療后數月至數年，常表現為心包滲出、冠狀動脈疾病、心瓣膜功能不全、傳導異常和充血性心衰等［9］。本實驗發現，與假損傷組比較，損傷后2周大鼠的心肌線粒體功能已發生改變，而離體心功能并無明顯改變，而線粒體功能受損后是否會引起心臟對損傷的敏感性增加尚不清楚。因此，我們選取大鼠RIHD后2周作為缺血/再灌注處理的時點，采用經典的結扎冠狀動脈建立缺血/再灌注模型，觀察心肌損傷的情況。目前，臨床上將cTnI特異性和CK-MB敏感性結合起來作為判斷心肌細胞損傷的重要指標［10］。組織解剖學上心肌梗死面積是觀察心肌損傷的直接指標。本實驗對RIHD模型大鼠進行缺血/再灌注處理，結果發現損傷+缺血/再灌注組大鼠與假損傷+缺血/再灌注組、損傷+假手術組比較，離體心功能明顯下降，血清cTnI和CK-MB顯著升高，心肌梗死面積明顯增大。這些結果提示，X線照射損傷增加了大鼠心肌對缺血/再灌注損傷的敏感性。然而具體機制還不清楚，有待于進一步研究。

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X-ray irradiation increases sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion injury in rats

WANG Jie1，LU Ke-yi2，ZHOU Jun-tao3，LI Xian-feng3
(1Department of Neurology，2Department of Nuclear Medicine，3Department of Radiotherapy，First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.E-mail:lixianfeng-lxf@263.net)

AIM:To observe the sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion(I/R)injury in the rats with chest radiotherapy.METHODS:The radiation-induced heart disease model was established by local 20 Gy of X-ray irradiation in the chest.Male Wistar rats(n=42)were randomly divided into 6 groups:sham trauma group，trauma group，sham trauma+sham operation group，sham trauma+I/R group，trauma+sham operation group and trauma+I/R group.The rats were subjected to 30 min of ischemia and 1 h of reperfusion 2 week after trauma.The left ventricular developed pressure(LVDP)and±dp/dtmaxwere recorded by BL-410 biological signal recording and analysis system.The serum cardiac troponin I(cTnI)and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were measured by ELISA.The myocardial infarct size was determined by nitroblue tetrazolium(NBT)staining method and BI2000 image analysis software.RESULTS:Compared with sham trauma+I/R group，significant decreases in LVDP and±dp/dtmaxwere observed in trauma+I/R group(P＜0.01)with significant increases in the infarct size and the concentrations of cTnI and CK-MB(P＜0.01).CONCLUSION:Chest X-ray irradiation increases the sensitivity of myocardium to I/R injury in rats.

Radiation-induced heart disease;Myocardial ischemia;Reperfusion injury;Sensitivity

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.007

1000-4718(2014)03-0419-04

2013-10-14

2014-01-16

國家自然科學基金資助項目(No.81371600);山西醫科大學科技創新基金資助項目(No.057279);山西醫科大學博士啟動基金資助項目(No.055217)

△通訊作者Tel:0351-4639351;E-mail:lixianfeng-lxf@263.net