邊 寧， 龔博君， 郭 軍， 黃正一， 李自成

(暨南大學附屬第一醫院心血管內科，廣東廣州 510630)

一氧化氮/誘導型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化過程中的作用*

邊 寧▲， 龔博君▲， 郭 軍， 黃正一， 李自成△

(暨南大學附屬第一醫院心血管內科，廣東廣州 510630)

目的：探討一氧化氮(NO)/誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)過程中的動態變化，分析其對動脈粥樣硬化形成過程的影響。方法：將60只SD大鼠隨機分成2組:對照組及AS組，每組30只。AS組采用維生素D3腹腔注射聯合高脂飼料飼養的方法構建動脈粥樣硬化模型。用相關生化方法檢測血清各項生化指標:總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖和鈣離子，比色法檢測血清NO濃度，并對主動脈行HE染色，免疫組化技術檢測iNOS蛋白表達，將所得數據進行統計分析，用簡單線性相關分析NO與鈣離子及動脈粥樣硬化指數的相關性。結果：90 d后成功構建了主動脈中膜鈣化型動脈粥樣硬化模型。血清NO濃度在動脈粥樣硬化過程中逐步下降，各組間差異均有統計學意義(均P＜0.05)。動脈粥樣硬化過程中動脈粥樣硬化指數與鈣離子呈正相關，與NO呈負相關。在90 d的AS組粥樣斑塊區免疫組化技術檢測到iNOS蛋白表達。結論：在動脈粥樣硬化形成過程中，主動脈粥樣斑塊區iNOS蛋白高表達，但血清NO濃度逐漸降低，NO抗動脈粥樣硬化作用減弱。

動脈粥樣硬化;一氧化氮;一氧化氮合酶;鈣

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發生的核心病理基礎。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一種氣體信號分子，又是一種有效的血管舒張因子［1］，研究報道其舒張血管作用為一氧化碳的300～1 000倍。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是機體內 NO產生的關鍵酶，其同功酶有3種亞型［2］:誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)、神經元型NOS和內皮型NOS。為探究NO/iNOS在動脈粥樣硬化過程中的作用，本研究擬采用維生素D3并高脂飼料構建動脈粥樣硬化模型，通過檢測血清中NO濃度的動態變化及iNOS在主動脈粥樣斑塊中的表達，以探討NO/iNOS與動脈粥樣硬化的關系。

材料和方法

1 方法

1.1 動物及造模 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體重160～200 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。動物許可證號為SCXK(粵)2008-0002，粵監證字為2008A020。隨機分成2組，對照組及動脈粥樣硬化組(atheroslerosis，AS)組，每組30只。對照組普通飼料飼養，AS組高脂飼料飼養。高脂飼料配方為:膽固醇4%，膽酸鈉0.5%，豬油10%，白糖5%，丙硫氧嘧啶0.2%，基礎飼料80.3%。生產許可證號為SCXK(粵)2008-0002。AS組大鼠于實驗開始前4 d給維生素D36×105U·kg-1·d-1腹腔注射，之后每30 d以3×105U·kg-1·d-1腹腔注射進行造模。

1.2 相關指標檢測 實驗開始當天、第45天及第90天將動物隔夜禁食，并于次日早晨8點10%水合氯醛麻醉后，用生化管腹主動脈采血，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、鈣離子(calcium ion，Ca2+)和空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)濃度分別采用TCH酶法、酶偶聯比色法、沉淀分離法、酶聯免疫法和葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測。動脈粥樣硬化指數(atherosclerosis index，AI)計算公式為:(TC-HDLC)/HDL-C。低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用公式計算:LDL-C= TC-HDL-C。

1.3 血清NO濃度的檢測 NO濃度檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，檢測過程嚴格遵循測試盒各項操作流程，采用比色法檢測。試劑盒測試原理為:NO在含氧及水的環境中可生成硝酸鹽及亞硝酸鹽，通過采用硝酸鹽顯示劑能使硝酸鹽及亞硝酸鹽轉化成偶氮化合物，再利用比色法間接測定血清中NO的濃度。

1.4 腹主動脈HE染色 對AS組90 d和對照組90 d主動脈行HE染色，在取主動脈樣本前用4%甲醛行心臟灌洗，分離主動脈，將其浸泡于4%甲醛中，時間控制在24 h內，之后以濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，包埋，切片，并行HE染色。

1.5 免疫組化染色檢測主動脈粥樣斑塊區iNOS的表達 兔抗大鼠 iNOS多克隆抗體購自 Abcam。PBS、檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、即用型封閉血清、3%H2O2、DAB顯色液和即用型免疫組織化學SP法染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用SP法進行免疫組織化學檢測，操作步驟照試劑盒說明書進行。顯微鏡觀察并拍照。

2 統計學處理

以SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。用簡單線性相關分析動脈粥樣硬化指數與NO和鈣離子的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 血脂指標在各組間的比較

AS組90 d TC、TG和HDL-C水平與對照組90 d比較，差異有統計學意義(均P＜0.05)，AS組90 d TC及LDL-C水平與AS組0 d間的差異有統計學意義(均P＜0.05)，AS組90 d TC與AS組45 d比較，差異有統計學意義(均P＜0.05)，見表1。

表1 血脂指標的比較Table 1.Comparison of the blood lipid parameters(Mean±SD)

2 一般指標在各組間的比較

AS組0 d、45 d及90 d空腹血糖和鈣離子水平在3組間的差異有統計學意義(均P＜0.05)。動脈粥樣硬化指數在AS組90 d明顯高于AS組45 d水平(P＜0.05)，見表2。

表2 動脈粥樣硬化形成過程中一般指標的比較Table 2.Comparison of common parameters in the process of atherosclerosis(Mean±SD)

3 血清NO濃度在各組間的比較

血清NO濃度在整個動脈粥樣硬化過程中呈現逐步下降的趨勢，在AS組90 d與0 d及45 d間的比較，差異均有統計學意義(均P＜0.05)，見表3。

表3 血清NO濃度在各組間的比較Table 3.Comparison of concentration of serum NO(Mean±SD)

4 相關性分析

對AS組動脈粥樣硬化指數與血清NO間行相關分析顯示，動脈粥樣硬化指數和血清NO間有相關性(r=-0.756，P＜0.01);動脈粥樣硬化指數和鈣離子間同樣具有相關性(r=0.738，P＜0.01)，見圖1、2。

5HE染色

主動脈病理學HE染色結果，圖3A示對照組90 d血管結構規整，中膜梭型平滑肌細胞清晰可見;圖3B示AS組90 d血管結構不完整，中膜被鈣化灶及斑塊所占據，灶區及斑塊區未見平滑肌細胞。

6 主動脈粥樣斑塊區域iNOS免疫組化染色

通過對照組90 d和AS組90 d腹主動脈行iNOS免疫組化染色對比發現，對照組為陰性(圖4A)，AS組90 d在不規則粥樣斑塊區可見棕黃色陽性表達(圖4B)，90 d時AS組iNOS蛋白表達顯著高于對照組(P＜0.05)。

Figure 1.The correlation between atherosclerotic index and serum NO level in rats.圖1 動脈粥樣硬化指數與血清NO的相關性

Figure 2.The correlation between atherosclerotic index and serum calcium ion concentration in rats.圖2 動脈粥樣硬化指數與血清鈣離子的相關性

Figure 3.The changes of atorta in control and AS group(HE staining，×100).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.圖3 SD大鼠主動脈HE染色

Figure 4.The expression of iNOS protein in aorta detected by immunohistochemistry(×200).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.圖4 SD大鼠主動脈iNOS蛋白的表達

討論

NO作為上世紀以來一種研究較熱門的氣體信號分子。NO/iNOS與動脈粥樣硬化［3］等其它心血管病關系密切。機體在正常情況下，NO主要在內皮型NOS關鍵酶的催化作用下由內皮細胞產生，當機體處于炎癥反應等受損狀態時，原本平滑肌細胞及巨噬細胞中處于低活性狀態下的iNOS被激活。動脈粥樣硬化過程中，一方面誘導型NOS催化下產生的NO通過與超氧陰離子結合生成過氧亞硝基陰離子［4］，另外機體不對稱二甲基精氨酸濃度將增高，抑制內皮型 NOS表達［5］，在上述兩方面的綜合作用下，體內NO濃度、活性及生物利用度降低，通過促進三磷酸鳥苷生成環磷酸鳥苷，導致細胞內游離鈣離子濃度增高，促進血管收縮，此外還可改變內皮細胞通透性，促使血管內皮功能紊亂，促進血管中膜損壞，加速動脈粥樣硬化斑塊形成。但具體機制尚未明確，有待進一步探究。既往研究報道原發性高血壓、動脈粥樣硬化及高脂血癥患者較健康對照人群比較體內NO基礎水平降低，可能與氧化應激關系密切［6］，但此結論尚未被公認。

本研究中，血清NO濃度在動脈粥樣硬化動態形成過程中呈現逐步下降趨勢，前45 d下降幅度低于后45 d，免疫組化結果顯示AS組90 d時主動脈斑塊區域iNOS蛋白高表達，在動脈粥樣硬化過程中呈上升趨勢。既往研究報道，高脂血癥狀態下，動脈內皮產生iNOS增多，使NO釋放增多，該病理狀態中常存在氧化應激反應，氧化應激體系中的超氧陰離子對機體所產生 NO以尚未明確的綜合機制迅速降解［7-8］，這是導致動脈粥樣硬化過程中iNOS表達增多但NO分泌減少的主要原因。本研究中NO呈現下降趨勢，iNOS蛋白表達增多，考慮與既往研究報道所述氧化應激作用有關。此外動脈粥樣硬化指數作為衡量動脈粥樣硬化嚴重程度的重要指標，在本研究中動脈粥樣硬化指數與NO呈負相關。以上結果說明了由于動脈粥樣硬化過程中NO功能逐步減弱，抗動脈粥樣硬化作用減弱，最終導致了動脈粥樣硬化的形成。

鈣離子作為機體重要的第二信使，其所參與的信號通路與動脈粥樣硬化過程、細胞凋亡及線粒體功能紊亂等機制關系密切。鈣離子內流增多導致細胞內鈣超載，促進細胞凋亡。既往報道金屬離子對動脈粥樣硬化斑塊的形成起促進作用［9-10］，動脈粥樣硬化斑塊中鈣離子濃度顯著高于正常組織［11］。動脈粥樣硬化形成過程脂質條紋、纖維斑塊及晚期復合斑塊中組織鈣含量分別為健康血管組織中的13倍、24倍及80倍。本研究中AS組45 d和90 d血清鈣離子濃度顯著高于同時段對照組水平，且相關分析中鈣離子水平與動脈粥樣硬化指數呈正相關，進一步在主動脈HE染色中，45 d和90 d血管中膜可見大量鈣化灶及斑塊出現。在上研究結果提示，鈣穩態失衡與動脈粥樣硬化關系密切。

本研究以鈣超載和高脂血癥為出發點，采用高脂飼料聯合維生素D3的方法，成功構建了主動脈中膜鈣化型動脈粥樣硬化模型。通過對NO/iNOS在動脈粥樣硬化過程中的具體變化進行實驗探究，發現在動脈粥樣硬化過程中斑塊中iNOS蛋白高表達，血清NO分泌逐漸減少，抗動脈粥樣硬化作用逐漸減弱，從而更有利于動脈粥樣硬化斑塊形成。以上研究結果可為臨床試驗和實驗研究提供相關依據。

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Effects of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase on process of atherosclerosis

BIAN Ning，GONG Bo-jun，GUO Jun，HUANG Zheng-yi，LI Zi-cheng
(Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:zichengli @163.net)

AIM:To explore the dynamic changes of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase during the process of atherosclerosis，and to analyze their influence on the formation of atherosclerosis.METHODS:SD rats(n= 60)were randomly divided into control group and atherosclerosis group(30 rats in each group).Atherosclerosis model was induced by feeding high-fat diet and vitamin D3.The values of blood biochemical were analyzed enzymatically using bioMérieux kit.The concentration of serum nitric oxideing was detected by a colorimetric method.The success of atherosclerosis modeling was determined by pathological examination.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in atherosclerotic plaque was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:The atherosclerosis model was successfully established in 90 d.The concentration of serum nitric oxide gradually decreased in atherosclerosis group，and a significant difference among groups was observed.Atherosclerosis index was positively correlated with calcium ion，and negatively correlated with nitric oxide.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the atherosclerotic plaque after 90 d was found.CONCLUSION:The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the plaque area of aorta increases and the concentration of serum nitric oxide decreases with the process of atherosclerosis.The anti-atherosclerosis role of nitric oxide is gradually decreased.

Atherosclerosis;Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Calcium

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.006

1000-4718(2014)03-0414-05

2013-12-27

2014-01-04

廣東省科技計劃項目(No.20101096136);廣州市科技計劃(No.2010Y1-C941);暨南大學第一臨床醫學院重點

學科基金(No.2010-4)

△通訊作者Tel:020-38688620;E-mail:zichengli@163.net

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