尹麗琴， 許銘炎， 陳錫和， 舒申友， 傅玉才， 鄧小玲

(1廈門市口腔醫院，福建廈門 361009;2汕頭大學醫學院細胞衰老實驗室，廣東汕頭 515041;3廈門大學醫學院基礎醫學部，福建廈門 361102)

轉錄因子YY1對口腔鱗癌細胞ITGB6基因表達的影響*

尹麗琴1，2， 許銘炎1△， 陳錫和2， 舒申友2， 傅玉才2， 鄧小玲3△

(1廈門市口腔醫院，福建廈門 361009;2汕頭大學醫學院細胞衰老實驗室，廣東汕頭 515041;3廈門大學醫學院基礎醫學部，福建廈門 361102)

目的：研究腫瘤相關轉錄因子YY1對口腔鱗癌細胞整合素β6(integrin β6，ITGB6)基因表達調控的影響。方法：用生物信息學方法預測分布在ITGB6啟動子區域的轉錄因子YY1潛在的結合位點，構建螢光素酶報告基因質粒，利用雙螢光素酶報告基因系統檢測ITGB6啟動子片段的轉錄活性;利用染色質免疫沉淀技術檢測在天然染色質條件下轉錄因子YY1與ITGB6啟動子的結合情況;采用定點突變方法檢測YY1結合位點對ITGB6啟動子活性的影響;利用RT-PCR方法檢測過表達轉錄因子YY1對口腔鱗癌細胞ITGB6 mRNA表達水平的影響。結果：ITGB6啟動子-421～-150 nt區域存在多個轉錄因子YY1潛在的結合位點。在口腔鱗癌細胞的天然染色質中，轉錄因子YY1結合于ITGB6啟動子-421～-150 nt區域;定點突變YY1潛在結合位點對口腔鱗癌細胞中ITGB6啟動子活性無顯著影響。另外，過表達的YY1對口腔鱗癌細胞ITGB6 mRNA的表達水平也無影響。結論：轉錄因子YY1在口腔鱗癌細胞中結合于ITGB6基因啟動子-421～-150 nt區域，但對ITGB6基因的基礎轉錄水平無影響。

YY1轉錄因子;整合素β6;口腔腫瘤

整合素是一種位于細胞表面、由α亞基和β亞基組成的跨膜異二聚體，介導細胞間和細胞與胞外基質間的信號轉導，其中由β6(integrin β6，ITGB6)亞單位和αv亞單位組成的整合素αvβ6只特異性在上皮組織中表達，不僅參與創傷愈合和炎癥反應時上皮組織重塑，而且與包括口腔鱗癌在內的多種惡性上皮源性腫瘤的發生發展密切相關［1-3］。整合素αvβ6在口腔鱗癌組織樣本中過度表達并位于侵襲組織的邊緣［4］，但正常口腔黏膜組織幾無表達，提示高表達的αvβ6參與口腔鱗癌的進展，但調控其過度表達的具體機制未知。由于ITGB6亞單位只與αv亞單位組成整合素αvβ6，因此ITGB6是控制整個異二聚體αvβ6表達的關鍵性亞單位。有報道轉錄因子Ets-1［5］、STAT3［6］、Smad和AP-1［7］參與不同種類細胞中ITGB6過度轉錄，然而，其它與腫瘤侵潤轉移相關的轉錄因子是否參與調控ITGB6的表達尚未見報道。

轉錄因子YY1是鋅指類轉錄因子Gli-Kruppel家族中的一員，也是polycomb group(PcG)蛋白家族中的一員，作為調控因子在多種組織中廣泛表達，參與染色質重塑、胚胎形成、細胞組織分化及腫瘤發生發展等生物學過程［8］。鑒于整合素αvβ6和YY1均參與腫瘤的侵潤和轉移，本研究以口腔鱗癌細胞為細胞模型，探討YY1對整合素αvβ6關鍵性亞單位ITGB6轉錄調控的影響。

材料和方法

1 細胞

人胚胎腎細胞株293T購買于武漢大學細胞典藏中心，口腔鱗癌細胞株SAS由哈爾濱醫科大學鄭金華教授惠贈。

2 主要試劑

高糖DMEM購自Invitrogen;胎牛血清購自Gibco;YY1、STAT3和β-actin抗體購于Santa Cruz。基因組DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和總RNA提取試劑盒及RNA逆轉錄試劑盒購自天根生化有限公司;感受態細胞(DH5α)、T4連接酶、KpnⅠ內切酶、XhoⅠ內切酶、pGL2-Basi載體和雙螢光素酶檢測系統購自Promega;pCMV-YY1由哈佛大學SHI Yang教授惠贈;轉染試劑METAFECTENE? EASY購自Biontex;細胞培養板購自Corning;引物合成及測序由北京六合華大基因有限公司完成。

3 主要方法

3.1 細胞培養 口腔鱗癌細胞SAS和293T細胞株均在5%CO2和37℃ 條件下，用含有10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養基培養。

3.2 ITGB6基因啟動子序列的生物信息學分析 利用NCBI基因組數據庫查找ITGB6基因序列(Ref-Seq:NC_000002.11/161056571…161057199)，使用McPromoter及NNPP軟件進行啟動子預測，TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)分析轉錄因子YY1潛在結合位點，確定ITGB6基因啟動子片段區域。

3.3 ITGB6啟動子螢光素酶報告基因質粒的構建提取口腔鱗癌細胞基因組DNA為模板，由ITGB6 -421F/ITGB6+208R、ITGB6-150F/ITGB6+208R和ITGB6(-421/-150)F/ITGB6(-421/-150)R分別組成3對引物(表1)擴增ITGB6 5＇側翼區，PCR反應條件:94℃ 5 min，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，33個循環，72℃ 10 min。PCR產物和PGL2-Basic載體共同經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收，T4連接酶連接，轉化，將轉化的菌液涂板于氨芐青霉素抗性的LB平板上，培養篩選重組子。挑取陽性菌抽提質粒，雙酶切，進行PCR，測序鑒定。重組質粒分別命名為pGL2-B6(-421/+208)、pGL2-B6(-150/ +208)和pGL2-B6(-421/-150)。

3.4 ITGB6-421～-150 nt區域點突變報告基因質粒的構建 首先利用上游引物引進突變位點方法構建YY1(1)和YY1(2)這2個位點的突變質粒:以質粒pGL2-B6(-421/-150)為模板，Mut YY1-1和 Mut YY1-2分別為上游引物、ITGB6(-421/-150)R為下游引物進行 PCR反應，PCR產物經酶切后克隆入pGL2-Basic載體中，構建重組質粒pGL2-B6-M-YY1 (1)和pGL2-B6-M-YY1(2)。其余3個位點的突變則使用重疊延伸法［9］構建:分別用 ITGB6(-421/ -150)F/Mut YY1-3R、ITGB6(-421/-150)F/Mut YY1 -4R、ITGB6(-421/-150)F/MutYY1-5R、ITGB6 (-421/-150)F/MutYY1-6R、MutYY1-3F/ITGB6 (-421/-150)R、Mut YY1-4F/ITGB6(-421/-150)R、Mut YY1-5F/ITGB6(-421/-150)R和 Mut YY1-6F/ ITGB6(-421/-150)R等引物進行PCR反應引入YY1突變位點，反應條件:94℃ 預變性5 min;95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;72℃10 min。PCR產物切膠回收并將相同突變位點的產物等量混合作為第2次PCR反應的模板，以ITGB6(-421/-150)F/ITGB6(-421/-150)R為引物，擴增出YY1位點的突變片段，經KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切后克隆入pGL2-Basic載體，構建重組質粒pGL2-B6-M-YY1(3)、pGL2-B6-M-YY1(4)、pGL2-B6-M-YY1 (5)和pGL2-B6-M-YY1(6)。PCR反應所用引物序列見表1。

表1 構建啟動子報告基因質粒的引物序列Table 1.Primers for generating promoter reporter constructs

3.5 瞬時轉染以及雙螢光素酶活性檢測 按照轉染試劑說明書，消化細胞，計數，將細胞懸浮液(5× 109cells/L)種于孔板。另外，準備轉染復合物，每孔質粒DNA與轉染試劑按1∶3比例用10 μL 1×EASY buffer稀釋，輕輕混勻，室溫孵育15 min，將轉染復合物逐滴滴入孔板中，每次試驗設置3個復孔。48 h后，提取蛋白，或者裂解細胞，按照雙螢光素酶檢測系統(Dual-Glo?Luciferase Assay System)操作手冊進行熒光檢測。檢測時間為10 s，重組質粒相對表達活性以螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性的比值來表示。

3.6 染色質免疫共沉淀［10］SAS細胞經胰酶消化離心后，用1%甲醛PBS交聯固定蛋白質-DNA復合物8 min，1.25 mol/L甘氨酸終止交聯5 min，2 800 r/ min 4℃離心10 min，PBS洗脫2次;加裂解液冰上裂解5 min，然后超聲破碎(功率200 W，超聲時間10 s，次數10次，間隔30 s)，將其隨機打斷為200～500 bp的染色質小片段;之后，染色質與YY1、STAT3特異性抗體及磁珠4℃回旋(35 r/min)過夜，RIPA磁鐵上洗脫3遍，68℃水浴2 h，苯酚氯仿抽提法提富集的DNA，PCR特異的擴增ITGB6啟動子-289/ -150 bp區域，擴增條件:94℃ 4 min，94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，30個循環。引物序列ITGB6(-289/-150)F:5’-TTCCTCATATATAGCCTATA-3’;ITGB6(-289/-150)R:5’-TAGAGAAAGTTAATATCTTTA-3’。

3.7 蛋白質免疫印跡 SAS細胞用預冷的PBS洗2次，加入 RIPA(以 1∶100的比例加入 PMSF 100 nmol/L)裂解液，細胞刮刮取細胞，冰上裂解30 min，每隔10 min振蕩1次，之后用1 mL針頭抽吸10～20次，12 000 r/min 4℃ 離心15 min，吸取上清，BCA法測蛋白濃度。蛋白進行SDS-PAGE電泳，電轉到硝酸纖維膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，YY1和β-actin抗體以1∶3 000的比例4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，Ⅱ抗室溫1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，ECL發光液顯影。

3.8 總RNA提取和RT-PCR反應 SAS細胞轉染48 h后，按總 RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA，用紫外吸收法測定RNA溶液濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒說明把RNA(1 μg)逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。ITGB6上游引物序列為5＇-GCAAGCTGCTGTGTGTAAGGA-3＇，下游引物序列為5＇-CTTGGGTTACAGCGAAGATCAA-3＇;β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-M)上游引物序列為5＇-AATCCAAATGCGGCATCT-3＇，下游引物序列為5＇-GAGTATGCCTGCCGTGTG-3＇。

4 統計學處理

數據以均數 ±標準差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0軟件對每種細胞內每個片段的活性分別與組內相鄰的組進行t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 ITGB6基因啟動子序列分析及啟動子活性鑒定

通過生物信息學方法分析，發現ITGB6基因啟動子近端(-421～+1)區域有6個YY1潛在結合位點(圖 1A;轉錄起始位點為 +1，結合基序: TATTT)。根據YY1潛在位點的分布，構建重組質粒pGL2-B6(-421/+208)和pGL2-B6(-150/+208)，轉染293T細胞，檢測相對螢光素酶活性，結果顯示(圖1B)當ITGB6啟動片段從-421截短到-150時，啟動子活性顯著下降，提示YY1潛在的結合位點可能參與ITGB6啟動子的轉錄調控。

Figure 1.The sequence analysis of ITGB6 promoter and relative luciferase activity of the constructs.A:prediction of the potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter;B:relative luciferase activity of the constructs.*P＜0.05 vs pGL2-B6(-421/+208).圖1 ITGB6基因啟動子序列分析及活性鑒定

2 口腔鱗癌細胞中轉錄因子YY1結合于ITGB6基因啟動子-289～-150 nt區域

為了驗證口腔鱗癌細胞中轉錄因子YY1是否結合于 ITGB6基因的啟動子區，分別使用 YY1和 STAT3(陽性對照)抗體進行染色質免疫共沉淀實驗，用-289～-150 nt區域特異引物PCR擴增，結果如圖2所示，在口腔鱗癌細胞中轉錄因子YY1結合于ITGB6基因啟動子-289～-150 nt區域。

Figure 2.Chromatin immunoprecipitation assay for YY1 binding to the-421～-150 nt region of ITGB6 promoter.圖2 染色質免疫共沉淀檢測YY1與ITGB6基因啟動子區-421～-150 nt體內結合情況

3 定點突變分析YY1結合位點對ITGB6基因啟動子活性的影響

為了檢驗ITGB6啟動子區中YY1潛在結合位點對ITGB6基因啟動子活性的影響，我們構建了6個定點突變質粒，瞬時轉染到293T細胞，檢測突變YY1潛在結合位點對ITGB6基因啟動子活性的影響，結果發現ITGB6啟動子區6個YY1潛在結合位點的逐個突變對相對螢光素酶活性沒有顯著影響，提示ITGB6基因-421～-150 nt區域啟動子活性并非依賴于該區域中單個YY1潛在結合位點(圖3)。

Figure 3.The effect of YY1 binding site mutants on ITGB6 transcriptional activity.圖3 YY1結合位點突變對ITGB6啟動子轉錄活性的影響

4 轉錄因子 YY1過表達對口腔鱗癌細胞ITGB6 mRNA表達水平的影響

為了進一步探討YY1對口腔鱗癌細胞ITGB6表達的影響，將YY1表達載體pCMV-YY1和空載體pCMV，瞬時轉染到口腔鱗癌細胞SAS中，48 h后，提取總蛋白，Western blotting法檢測YY1在SAS細胞中過表達(圖4A)。同樣方法轉染SAS細胞，提取總RNA，進行PCR，結果顯示，過度表達的YY1對口腔鱗癌細胞ITGB6 mRNA表達水平無顯著影響(圖4B)。

討論

Figure 4.The effects of YY1 over-expression on ITGB6 mRNA expression.A:YY1 over-expression in SAS cells;B: ITGB6 mRNA expression in SAS cells.Lane 1:control;Lane 2:pCMV;Lane 3:pCMV-YY1.圖4YY1過表達對ITGB6 mRNA水平的影響

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種常見的實體腫瘤，占所有惡性腫瘤的4%。在全世界范圍內，每年都有超過10萬人死于OSCC。有研究顯示:口腔鱗狀細胞癌的發病呈年輕化上升趨勢［11］。腫瘤的侵襲和轉移是造成患者死亡的主要原因，因此，探討與侵襲和轉移相關的整合素β6基因表達調控的機制具有重要的科學意義。

啟動子作為基因表達調控的“開關”，決定基因的活動。本研究利用螢光素酶報告基因系統及生物信息學技術，發現ITGB6啟動子區-421～+1之間有6個YY1潛在結合位點，進一步應用染色質免疫沉淀發現口腔鱗癌細胞中轉錄因子YY1可結合于ITGB6啟動子-421～-150 nt區域，提示YY1可能參與口腔鱗癌細胞ITGB6基因的轉錄調控。接著，我們對ITGB6啟動子區-421～-150 nt區域中YY1潛在結合位點分別進行定點突變，發現YY1潛在結合位點的突變對報告基因表達活性無顯著影響，進一步在口腔鱗癌細胞中過表達 YY1，也未檢測到ITGB6 mRNA表達水平的變化，所有結果提示轉錄因子YY1并不參與ITGB6基因的基本轉錄調控。有報道，轉錄因子可以結合在基因啟動子區參與組成轉錄調控復合物，但是不參與基因轉錄激活［12］，因此可以推測，轉錄因子YY1可能參與ITGB6基因轉錄調控復合物的形成，但是不參與ITGB6基因基本轉錄的激活。

此外，我們的研究是在基礎情況下進行的，在其它誘導劑及細胞因子等影響下，轉錄因子YY1對口腔鱗癌細胞中ITGB6表達調控是否有影響，有待進一步研究。

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Role of transcription factor YY1 in regulation of ITGB6 gene expression in oral squamous cell carcinoma

YIN Li-qin1，2，XU Ming-yan1，CHEN Xi-he2，SHU Shen-you2，FU Yu-cai2，DENG Xiaoling3
(1Xiamen Stomatological Hospital，Xiamen 361009，China;2Laboratory of Cellular Senescence，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China;3Department of Basic Medicine，Xiamen University Medical College，Xiamen 361102，China.E-mail:myxu1972@yahoo.com;caseydxl@yahoo.com)

AIM:To explore the role of transcription factor YY1 in the regulation of integrin β6(ITGB6)gene expression in oral squamous cell carcinoma.METHODS:The distribution of the potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter were predicted by bioinformatic methods.Series of 5＇deletion of ITGB6 promoter luciferase reporter constructs containing potential YY1 binding sites were made and transfected into 293T cell line to detect the promoter activity.The binding activity of the transcription factor YY1 to ITGB6 promoter in the native chromatin environment was determined by chromatin immunoprecipitation(ChIP)assay.The role of the potential YY1 binding sites in the regulation of ITGB6 promoter activity was analyzed by substitution mutant analysis.The effect of YY1 over-expression on the mRNA expression of ITGB6 in oral squamous cell carcinoma cell line was measured by RT-PCR.RESULTS:Bioinformatics analysis revealed that there were several potential binding sites for YY1 in the region of-421～-150 nt in the ITGB6 promoter.ChIP assay showed that transcription factor YY1 bound to the ITGB6 promoter region of-421～-150 nt in the native chromatin environment.Substitution mutant analysis of potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter did not affect the promoter activity of ITGB6.The over-expression of YY1 in oral squamous cell carcinoma cells did not affect the ITGB6 mRNA expression.CONCLUSION:The transcription factor YY1 binds to the region of-421～-150 nt in the ITGB6 promoter.However，it is not involved in the basic transcriptional regulation of ITGB6 gene in oral squamous cell carcinoma cells.

YY1 transcription factor;Integrin β6;Mouth neoplasms

R394.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.002

1000-4718(2014)03-0394-06

2013-10-16

2014-01-24

國家自然科學基金資助項目(No.30900661;No.81072208;No.81370160);教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目;汕頭大學醫學院基礎與臨床科研基金資助項目

△通訊作者Tel:0592-2678587;E-mail:許銘炎myxu1972@yahoo.com;鄧小玲E-mail:caseydxl@yahoo.com