陳 鯤， 陳永順， 王雪君， 陳韻帆， 劉軻莉， 陳鳳佳， 魯建軍△

(1廣州大學基因干擾研究所，廣東廣州 510006;2中山大學附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州 510080)

·論 著·

Et-DHA通過激活線粒體途徑和T細胞granzyme B誘導HepG2細胞凋亡*

陳 鯤1， 陳永順1， 王雪君1， 陳韻帆1， 劉軻莉1， 陳鳳佳2， 魯建軍2△

(1廣州大學基因干擾研究所，廣東廣州 510006;2中山大學附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州 510080)

目的：本研究探討了二十二碳六烯酸乙酯(Et-DHA)對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響。方法：HepG2細胞用于檢測Et-DHA的抑癌活性，MTT法檢測Et-DHA對HepG2細胞的直接抑制作用，Hoechst 33258熒光染色觀察細胞的形態(tài)特征，ELISA法檢測Et-DHA處理后HepG2細胞的活性氧簇(ROS)釋放量、總超氧化物歧化酶(SOD)和caspase-9活性，Western blotting法檢測胞質和線粒體中Bax、Bak、Bid、Bcl-2、Smac和細胞色素C(Cyt C)，以及胞質中cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平;T細胞與HepG2細胞共培養(yǎng)，進一步觀察Et-DHA處理后T細胞的增殖對HepG2細胞活性的影響，并檢測了顆粒酶(granzyme)B的水平。結果：Et-DHA顯著抑制HepG2細胞的生長(P＜0.05)，這種抑制作用具濃度效應和時程效應;Et-DHA處理后HepG2細胞的ROS釋放量增加，但總SOD活性無明顯變化，caspase-9活性顯著上升(P＜0.05);線粒體上的促凋亡蛋白Bax、Bak和Bid水平增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2以及線粒體中Cyt C和Smac的水平降低，胞質中的Cyt C、Smac、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3以及cleaved Bid水平呈劑量性升高。另外T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng)組在Et-DHA的誘導下，HepG2細胞的凋亡程度與Et-DHA單獨作用時相比進一步增加。在Et-DHA刺激下，T細胞內granzyme B上調，釋放到HepG2細胞內的granzyme B明顯增多。結論：Et-DHA可能主要通過線粒體內源性途徑以及caspase-8途徑，激活caspase-3，誘導HepG2細胞凋亡，以及通過間接活化T細胞，促使 granzyme B增多，從而增強對HepG2細胞的毒性作用。

二十二碳六烯酸;HepG2細胞;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9;顆粒酶B;細胞色素C;Smac蛋白

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA，22:6 n-3)是一種n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，在海洋動物體內含量豐富。近年來作為一種保健食品，具有較好的預防和治療癌癥、降低腫瘤的發(fā)生及抗炎等功效，備受廣泛關注［1］。n-3多不飽和脂肪酸［二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和DHA］可通過調節(jié)肺癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞的凋亡蛋白如Bax的活性和表達，誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤細胞的異常增殖具有一定的抑制作用［2-6］。n-3多不飽和脂肪酸還可提高腫瘤化療藥物的療效。離體實驗表明，EPA和DHA可提高許多常用抑癌藥物(阿霉素、三氧化二砷、絲裂霉素、紫杉醇、表阿霉素、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷)對結腸癌、神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、膀胱癌和膠質母細胞瘤等細胞株的抑制作用［2，7-9］。在體實驗表明，飼料中添加DHA并聯(lián)合應用5-氟尿嘧啶可減少荷瘤動物腫瘤塊的大小［10］。臨床實驗表明，EPA和DHA可增加結腸癌對依立替康的敏感性［1］，給非小細胞肺癌患者每天添加2.5 g EPA和DHA，化療效果可提高約2倍，平均延長3周的化療時程，從而增加患者的存活率［11］。

人類肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的五大癌癥之一，目前對于肝癌還沒有有效的二級預防或系統(tǒng)性治療，肝癌患者的整體存活率較低。相對于DHA對其它惡性腫瘤抑制作用的報道，目前DHA對原發(fā)性肝癌作用的報道較少［2-3］。一項超過9萬多人的統(tǒng)計表明多食魚類和含量高的n-3 PUFAs的食物可以顯著降低肝癌的發(fā)生率［1］。有研究揭示不飽和脂肪酸可調節(jié)肝細胞(HepG2細胞)纖溶酶原激活劑抑制物1的基因轉錄。雖然已有實驗證據(jù)表明n-3 PUFA可預防癌變，DHA可通過影響轉錄因子和基因表達、增強脂質過氧化作用、抑制類花生酸的生物合成等方面誘導腫瘤細胞凋亡［1，12］，但是對n-3 PUFAs的抑癌分子機制仍然沒有完全闡明，特別是關于DHA對人肝癌HepG2細胞抑制作用的分子機制仍不十分清楚。本研究觀察二十二碳六烯酸乙酯(ethyl DHA，Et-DHA)對HepG2細胞增殖和凋亡的影響，并探討Et-DHA對T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng)的作用的分子機制，為肝癌病防治提供新的靶點和策略。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康成年SPF清潔級BALB/c小鼠，18～22 g，8周齡，購自中山大學實驗動物中心。所有實驗操作以及動物使用都嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導意見》(中國科技部2006)以及廣州大學及中山大學動物倫理法規(guī)。

1.2 材料 人肝癌HepG2細胞由南京大學劉暢教授惠贈;Et-DHA(22:6Δ4，7，10，13，16，19)購自東京化成工業(yè)株式會社(Tokyo)，純度高于98%，-20℃保存;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)購自Gibco;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力測定試劑盒和活性氧簇(reactire oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;caspase-9活性檢測試劑盒購自上海貝博;所有其它的試劑盒均購自Sigma。

2 細胞培養(yǎng)和處理

2.1 脾淋巴細胞的制備和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡2 min，無菌條件下切取小鼠脾臟。機械分離脾細胞，用200目濾網(wǎng)過濾，離心后用紅細胞裂解液去除紅細胞，再用 PBS清洗2次，4℃、3 000×g離心1×10 min，離心后加入培養(yǎng)液，制成細胞懸液，先用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)12 h，然后吸取細胞懸液，純化T細胞，分到6孔板上，并調整細胞濃度為1×108/L。進行藥物處理2 d后觀察并拍照。

2.2 HepG2細胞培養(yǎng) 使用包含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細胞。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)條件5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱，細胞貼壁生長。細胞分到培養(yǎng)皿時密度大約為 1×108/L。實驗組在DMEM培養(yǎng)液內加入Et-DHA(終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L)培養(yǎng)24 h，對照組加等體積的DMEM。通過預實驗確定本實驗的Et-DHA濃度。每個實驗重復3次。

2.3 T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng) 在已經(jīng)貼壁的HepG2細胞中按T細胞與刺激細胞10∶1的比例加入T細胞懸液培養(yǎng)24 h和48 h作為實驗組，對照組加入相同體積的10 μmol/L Et-DHA。

3 主要方法

3.1 MTT比色法測定細胞活性 將HepG2細胞以1×108/L的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)液中各加入不同濃度的Et-DHA(終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L)，培養(yǎng)24 h和48 h后，用MTT比色法測定細胞活性。

按照1×108/L細胞接種密度對HepG2細胞進行培養(yǎng)，依據(jù)之前設計的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實驗所需的細胞。用裂解液裂解HepG2細胞，按說明書內的規(guī)定操作程序來測定SOD，采用酶標儀(Spectra MAX 340)在波長為550 nm處檢測SOD吸收值。

3.2 細胞形態(tài)分析 為了觀察HepG2細胞在凋亡過程中發(fā)生的形態(tài)變化，用 Hoechst 33258處理HepG2細胞。在室溫下將HepG2細胞用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.02 mol/L PBS洗滌3次，避光條件下添加10 g/L Hoechst 33258染色10 min，在熒光顯微鏡下(Nikon)用×100和×200的放大倍數(shù)觀察細胞。在倒置相差顯微鏡(×100和×400)下觀察T細胞。

3.3 ROS含量的測定 按照1×108/L細胞接種密度對HepG2細胞進行培養(yǎng)，依據(jù)之前設計的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實驗所需的細胞。使用DCFH-DA熒光染色法測定細胞內的活性氧簇的含量。DCFH-DA本身沒有熒光，可自由穿過細胞膜，進入細胞內后，細胞內的H2O2等小分子量的過氧化物，即在有ROS的情況下DCFH-DA能夠被氧化為生成熒光的二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)，其熒光強度與細胞內的ROS的水平成正比。Et-DHA處理過的HepG2細胞用10 mmol/L的DCFH-DA孵育30 min，PBS清洗2遍，最后DCF的生成量通過酶標儀讀數(shù)得到，其激發(fā)波長為500 nm，發(fā)射波長為530 nm。

3.4 總SOD活性測定 按照1×108/L接種密度對HepG2細胞進行培養(yǎng)，依據(jù)之前設計的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實驗所需的細胞。用裂解液裂解HepG2細胞。按說明書內的規(guī)定操作程序來測定SOD，采用酶標儀在波長為550 nm處來檢測SOD吸收值。重復3次，計算出平均值。總SOD活性(103U/L)=(對照管吸光度-測定管吸光度) ÷50% ×(反應液總量÷所取樣品量)。

3.5 Caspase-9活性的測定 以1×108/L細胞接種密度培養(yǎng)HepG2細胞，按照設計的濃度添加Et-DHA繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，用裂解液裂解HepG2細胞。用考馬氏亮藍法測定蛋白濃度，然后按試劑盒說明書操作測定caspase-9活性，使用酶標儀在405 nm波長處測定caspase-9的吸收值。計算各Et-DHA實驗組caspase-9與對照組細胞caspase-9的相對活性。實驗重復3次，取平均值。

3.6 Western blotting檢測蛋白的表達 細胞接種于6孔板，進行藥物處理，終止培養(yǎng)后細胞溶解于lysis buffer［10 mmol/L HEPES(pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，和0.5%NP-40］中，而后收集細胞至離心管中13 200 r/min離心10 min。選用Folin-酚法測定蛋白酶濃度，以每泳道40 μg蛋白等量上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉膜至硝酸纖維膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗(1∶1 000)孵育;Ⅱ抗使用羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育后，進行ECL檢測顯影、定影、洗印膠片。Caspase-3 antibody(rabbit，1∶1 000)、caspase-9 antibody(human specific，1∶1 000)、caspase-8 (1C12) antibody (mouse，1∶1 000)、Smac/Diablo antibody(mouse，1∶1 000)、Bid antibody(human specific，1∶1 000)、Bcl-2 antibody(rabbit，1 ∶1 000)、Bax antibody(rabbit，1∶1 000)、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)antibody(rabbit;1∶1 000)、Bak antibody(rabbit，1∶1 000)和顆粒酶(granzyme)B antibody(rabbit，1∶1 000)均購自 Cell Signaling Technologies，其它抗體購自Santa Cruz Biotechnology。電泳條帶的強度用 Lab-Works Image Analysis software進行定量分析。

3.7 線粒體和胞漿蛋白分離提取 根據(jù)線粒體分離試劑盒(Pierce)使用說明手冊操作。細胞接種于6孔板，DHA處理，終止培養(yǎng)后收集細胞至1.5 mL離心管中，在冰浴預冷的Mito-Cyto緩沖液中吹打重懸，移入Wheaten Dounce玻璃勻漿器冰浴中勻漿5 min。勻漿液于4℃、800×g離心10 min，取上清液進一步于4℃、10 000×g離心30 min，收集上清液即得到的胞漿成分(不含細胞核和線粒體)。下面部分即為線粒體部分，用 Mito-Cyto緩沖液 (0.2 mL)重懸，600×g離心5 min，以去除一些顆粒物，再12 000×g離心15 min，懸浮在Mito-Cyto Buffer中的即為線粒體蛋白［13］。測定蛋白含量后進行Western blotting分析。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。差異顯著性用單因素方差分析(ANOVA)與進行多組樣本間差異顯著性分析或用Origin 7.0來進行Fisher確切概率檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Et-DHA對HepG2細胞數(shù)量的影響

HepG2細胞(1.0×108/L)在 10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L的Et-DHA培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，隨著Et-DHA濃度上升，HepG2細胞的密度和數(shù)量顯著下降，與對照組相比分別為98%、90%、80%和70%，見圖1。

Figure 1. EffectofEt-DHA on numberofHepG2 cells (×100).A:control group;B:10 μmol/L Et-DHA;C:30 μmol/L Et-DHA;D:100 μmol/L Et-DHA;E:300 μmol/L Et-DHA.圖1 不同濃度Et-DHA處理對HepG2細胞數(shù)量的影響

2 Et-DHA對HepG2細胞活性的抑制作用

用MTT比色法檢測Et-DHA是否對HepG2細胞的活性具有抑制作用。Et-DHA作用24 h和48 h后，HepG2細胞的活性顯著降低。抑制作用隨著Et-DHA濃度(10、30、100和300 μmol/L)的增加以及時間的延長而增強，與對照組(0 μmol/L Et-DHA)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.MTT assay was performed at 24 h and 48 h after the cells were exposed to Et-DHA.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同濃度Et-DHA處理HepG2細胞24 h和48 h后的細胞生長抑制曲線

3 Et-DHA對HepG2細胞核形態(tài)的影響

如圖3所示，對照組細胞核發(fā)淡藍色，較大較圓，色澤均一，形態(tài)規(guī)則，表面光滑。100 μmol/L Et-DHA處理后，HepG2細胞核呈高染色密度，核濃縮，細胞膜出泡，核仁裂解，染色體在核膜周邊凝聚，凋亡小體形成，這些都呈現(xiàn)程序性細胞凋亡的特征。

Figure 3.Effect of Et-DHA on the morphology of HepG2 cell nucleus(×400).A:control group cells were pale blue and round;B:after treated with 100 μmol/L Et-DHA，the HepG2 cells revealed a marked nuclear condensation，membrane blebbing，nuclear fragmentation and apoptotic bodies，all of which were the characteristics of apoptotic programmed cell death.圖3 Et-DHA對HepG2細胞核形態(tài)的影響

4 Et-DHA誘導HepG2細胞凋亡的機制

4.1 Et-DHA對HepG2細胞內ROS的影響 如圖4所示，與對照組比較，Et-DHA誘導HepG2的細胞ROS含量均明顯增加，且呈劑量-效應關系。經(jīng)10、30、100和300 μmol/L Et-DHA處理后，DCF出現(xiàn)了近1.3、1.8、2.2和2.5倍的增加。研究表明ROS會導致線粒體膜通透性以及結構的改變［14］，因而上述結果提示Et-DHA導致HepG2細胞ROS的大量產(chǎn)生，可能是誘導HepG2細胞凋亡的原因。

Figure 4.Effect of Et-DHA on the level of ROS in HepG2 cells.*P＜0.05 vs control group.圖4 Et-DHA對ROS量的影響

4.2 Et-DHA對HepG2細胞總SOD活性的影響Et-DHA作用48 h對HepG2細胞的總SOD活性并無顯著影響，提示Et-DHA處理后HepG2細胞的抗氧化能力水平?jīng)]有顯著改變，見表1。

表1 Et-DHA對HepG2細胞總SOD活性的影響Table 1.Effect of Et-DHA on total superoxide dismutase(SOD) activity in HepG2 cells(Mean±SD.n=3)

4.3 Et-DHA對HepG2細胞Bax、Bak和Bid線粒體轉位、Bid活化及Bcl-2表達的影響 不同濃度的Et-DHA作用HepG2細胞48 h后，線粒體上的Bax、Bak和Bid的水平均顯著高于對照組(P＜0.05);Bcl-2水平較對照組下調(P＜0.05)，表明Et-DHA誘導HepG2細胞凋亡可能主要激活了線粒體凋亡通路。而細胞質中cleaved Bid上調，提示Et-DHA可能也激活了caspase-8凋亡途徑，從而活化Bid，見圖5。

4.4 Et-DHA對HepG2細胞Cyt C和Smac釋放的影響 Et-DHA作用HepG2細胞48 h后，胞漿中Cyt C和Smac水平呈劑量依賴性增加，而線粒體內Cyt C和Smac呈劑量依賴性降低，見圖6。

Figure 5.Western blotting analysis of Bid activation，Bcl-2 expression，and Bax，Bak and Bid mitochondrial translocation during Et-DHA-induced apoptosis in HepG2 cells.圖5 Et-DHA對Bid活化、Bcl-2表達及Bax、Bak和Bid線粒體轉位的影響

Figure 6.Effects of Et-DHA on the release of Cyt C and Smac in HepG2 cells during apoptosis.圖6 Et-DHA對Cyt C和Smac釋放的影響

4.5 Et-DHA對HepG2細胞caspase-8、caspase-9和caspase-3的影響 如圖7所示 10 μmol/L以及30 μmol/L Et-DHA處理HepG2細胞48 h后，caspase-8和caspase-9酶原被同性活化，被切割成有活性的cleaved caspase-8和 cleaved caspase-9，其中 cleavedcaspase-9水平顯著增加，并具劑量-效應關系。我們繼而檢測了下游的效應分子 caspase-3，結果表明caspase-3酶原也被劑量依賴性切割成 cleaved caspase-3。以上結果表明Et-DHA主要通過線粒體內源途徑以及部分caspase-8外源途徑交互作用，激活caspase-3，誘導HepG2細胞凋亡。

Figure 7.Effects of Et-DHA on the activation of caspase-8，caspase-9 and caspase-3 in HepG2 cells.圖7 Et-DHA對caspase-8、caspase-9和caspase-3活化的影響

4.6 Et-DHA對HepG2細胞caspase-9活性的影響

Et-DHA作用HepG2細胞48 h后，HepG2細胞caspase-9活性增加，并呈劑量-效應關系，與對照組相比，P＜0.05，見圖8。此結果進一步表明線粒體內源途徑參與了Et-DHA誘導HepG2細胞凋亡。

Figure 8.Effect of Et-DHA on caspase-9 activity in HepG2 cells after 48 h of exposure.*P＜0.05 vs control group.圖8 不同濃度 Et-DHA處理 HepG2細胞 48 h后對caspase-9活性的影響

4.7 Et-DHA對T細胞殺傷HepG2細胞的影響 10 μmol/L Et-DHA促使 T細胞增殖約70% ～90% (P＜0.05)，見圖9A。當10 μmol/L Et-DHA與T細胞共同培養(yǎng)24 h后，HepG2細胞比單獨使用Et-DHA時顯著減少，并且具有時程-效應關系(P＜0.05);當培養(yǎng)48 h時，在Et-DHA和T細胞的共同作用下，HepG2細胞數(shù)量比Et-DHA單獨作用時顯著減少，見圖9B。以上結果表明Et-DHA可能通過活化T細胞，促進HepG2凋亡。

4.8 Et-DHA對T細胞granzyme B蛋白表達的影響不同濃度的Et-DHA作用T細胞48 h后，granzyme B較對照組表達顯著上調(P＜0.05)，見圖10A;在Et-DHA作用于HepG2細胞或T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng)48 h后，移去T細胞，共培養(yǎng)組HepG2細胞內granzyme B水平較空白對照組以及HepG2組上調，granzyme B釋放到HepG2細胞內較明顯，見圖10B。而空白對照組以及 Et-DHA組 HepG2內granzyme B的水平很低(第1、2條帶)，在與T細胞共培養(yǎng)后，HepG2內granzyme B的水平顯著增加(第3條帶)，而共培養(yǎng)體系中從HepG2細胞中洗脫的T細胞granzyme B較明顯(第4條帶)。以上結果表明Et-DHA可能通過誘導T細胞釋放granzyme B，殺傷HepG2細胞，從而間接誘導HepG2細胞凋亡。

討論

在近來研究中，EPA和DHA因其具有的預防、抑癌能力及改善心血管功能等功效而倍獲關注［1，15］。目前國內外已有許多關于EPA和DHA抗癌機制的研究，主要集中在以下幾方面:(1)改變腫瘤細胞膜的結構，(2)破壞機體脂肪酸的形成，(3)阻斷腫瘤細胞的信號轉導途徑，(4)改變體內的脂類代謝［16］。本研究旨在探究Et-DHA誘導的HepG2細胞凋亡是否依賴于脂質過氧化物的過度積累觸發(fā)凋亡效應，以及Et-DHA激活T細胞后抑癌作用的分子機制。

實驗結果顯示，Et-DHA作用于HepG2細胞24 h后，均可觀察到各濃度實驗組的HepG2細胞的密度呈劑量依賴性下降，非貼壁的漂浮細胞增多。這與Araseki等［17］的研究顯示HepG2細胞經(jīng)油酸、花生四烯酸和DHA聯(lián)合處理后，HepG2細胞存活率呈濃度依賴性下降的結果較一致。MTT檢測結果顯示，Et-DHA對HepG2細胞的存活率有顯著抑制作用，隨著Et-DHA的濃度和給藥持續(xù)時間的增加，抑制率顯著增強。在Hochest 33258熒光染色實驗中，Et-DHA各濃度組細胞核呈高染色密度，染色體呈強藍色熒光，核仁裂解，染色體在核膜周邊凝聚，碎裂等在細胞程序性凋亡過程中的特征，而對照組細胞不呈現(xiàn)以上特征，暗示Et-DHA可能通過脂質過氧化等途徑誘導HepG2細胞凋亡［14，16］。

Figure 9.Effect of Et-DHA on HepG2 cells during co-cultured with T cells(×100).A:T cells treated with Et-DHA;B:HepG2 cells treated with Et-DHA and co-cultured with T cells.圖9 HepG2細胞與T細胞共培養(yǎng)24 h和48 h后，Et-DHA對HepG2細胞的影響

DHA作為一種長鏈多不飽和脂肪酸，富集于細胞膜上，化學性質不穩(wěn)定，容易受到其他離子的攻擊，發(fā)生脂質過氧化反應。DHA可通過氧化應激，增強細胞膜的脂質過氧化作用、抑制類花生酸的生物合成等方面誘導腫瘤細胞凋亡［1，14］。盡管本實驗檢測Et-DHA處理HepG2細胞后，各濃度組總SOD活力并無明顯變化，HepG2腫瘤細胞的抗氧化水平即清除ROS水平?jīng)]有統(tǒng)計學意義上的改變，但檢測出ROS呈劑量性顯著升高，提示這可能與Et-DHA處理HepG2細胞后，膜上含有大量的易被氧化的DHA，氧化應激引起脂質過氧化作用增強有關，與DHA通過影響ROS代謝從而調節(jié)結腸癌細胞生長和死亡機理類似［5］，也與乳腺癌病人每天補充DHA血液循環(huán)磷脂增加后，其化療效果明顯改善的機制類似［12］。而過量累積的ROS會導致線粒體DNA損傷、以及線粒體膜通透性以及結構的改變，繼而引發(fā)凋亡效應［14］。結果與直接暴露HepG2細胞于2 mmol/L過氧化氫，產(chǎn)生氧化應激能誘導 HepG2肝癌細胞發(fā)生凋亡的機制類似［17］

細胞接受凋亡信號(ROS、不可修復DNA損傷等)后，胞內凋亡信號“感受器”(Bid、Bad等)被活化的caspase-8切割后，也被活化，從而對Bcl-2家族包括凋亡抑制因子(Bcl-2、Bcl-xL)等起拮抗作用。從而使處于抑制狀態(tài)的凋亡促進因子(Bax、Bak等)釋放出來，從細胞質中轉移到線粒體外膜上，并發(fā)生寡聚化，并與膜上電壓依賴性陰離子通道相互作用，改變膜的通透性，使線粒體內的凋亡因子 Cyt C和Smac等釋放到細胞質中，引發(fā)細胞凋亡［18］。本研究通過Western blotting測定Et-DHA處理HepG2細胞后，線粒體上的Bax、Bak以及Bid水平上調，胞漿中的Bid被切割，Bcl-2表達下調，而Bax/Bcl-2比值的改變可影響細胞對誘發(fā)凋亡的敏感性，揭示Et-DHA可能通過激活線粒體途徑，誘導HepG2細胞凋亡。我們進一步檢測到胞漿中的Cyt C和Smac水平升高，而線粒體中的 Cyt C和 Smac水平下降，提示HepG2細胞接收凋亡信號后，在Bax和Bak等凋亡因子的作用下，通透性增加，Cyt C和Smac從線粒體中釋放到細胞質中，從而激活下游的 caspase-9及caspase-8家族等凋亡因子。本結果與DHA通過選擇性調節(jié)凋亡蛋白和通路，誘導結腸癌細胞生長和死亡的機制類似［5］。

Figure 10.Western blotting analysis of granzyme B secreted by T cells(TC)and penetrated into HepG2 cells during co-culture and Et-DHA(DHA)treatment for 24 h.A:effect of DHA on granzyme B protein expression in TC;B:granzyme B protein in HepG2 cells without treatment(HepG2)，DHA-treatedHepG2 cells (DHA+HepG2)，DHA-treated HepG2 cells co-cultured with TC(TC were removed;DHA+HepG2/ TC)，and TC washed from DHA-treated HepG2 cell co-culture(DHA+TC).圖10 Et-DHA對T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng)體系中granzyme B表達的影響

Caspases家族是驅動凋亡的分子開關，起始caspase以及效應caspase具有同性活化和異性活化的特征。被活化的 caspase-9和caspase-8則接著激活位于級聯(lián)反應下游的效應caspase-3，使級聯(lián)反應快速地擴大。而caspase-9是線粒體的凋亡程序中不可或缺的起始因子，本實驗結果顯示，HepG2細胞經(jīng)Et-DHA處理后，caspase-9和 caspase-3被切割成cleaved caspase-9和cleaved caspase-3，caspase-9的活性大大提高，且與其濃度呈正相關，提示caspase-9是Et-DHA抑制HepG2細胞生長的重要參與者。凋亡程序的開始信號到達線粒體以后，誘導線粒體排放出Cyt C，之后Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子1反應，并使其空間結構改變成為八聚體，后者和caspase-9反應并導致它開始活化自身，進而切割下游的caspase-3。活化的效應 cleaved caspase-3可活化caspase激活的脫氧核糖核酸酶，切割DNA成200 bp的DNA片段，誘發(fā)HepG2細胞凋亡。根據(jù)以上結果推測，Et-DHA處理后HepG2細胞的凋亡方式，與白細胞介素4誘導HepG2細胞凋亡類似，主要與線粒體凋亡途徑相關［13］。

此外，我們的結果還顯示細胞質中caspase-8和Bid也微弱地被切割，并且Smac的水平升高。以上結果提示，Et-DHA抑制HepG2細胞生長，也可能部分通過激活caspase-8內源凋亡途徑。這與EPA通過ROS堆積、caspase-8活化以及自噬誘導胰腺癌凋亡的機制類似［13］。

先前的研究表明自然殺傷細胞對不同肝癌細胞株(K562、BEL-7402、SMMC-7721和HepG2)具有一定的殺傷作用［19］，那么Et-DHA在機體內是否可通過活化T淋巴細胞perforin-granzyme B途徑來誘導HepG2細胞凋亡呢?為了驗證以上設想，我們采用淋巴細胞和HepG2共培養(yǎng)體系，模擬了機體內細胞生存環(huán)境，觀察Et-DHA是否間接通過激活T細胞，從而增加 T細胞殺傷 HepG2效應。結果表明Et-DHA誘導T細胞增殖，當共培養(yǎng)時，與Et-DHA單獨處理HepG2細胞相比，其凋亡率更顯著。以上結果暗示Et-DHA通過活化T淋巴細胞，促使增殖，并釋放細胞因子，對HepG2細胞的毒性增強，從而間接抑制HepG2細胞的生長［20］。

當激活的細胞毒性T細胞與靶細胞結合后，經(jīng)顆粒胞吐方式，效應細胞釋放致密的胞質顆粒及其內容物到達靶細胞和效應細胞的結合位點處，對靶細胞進行致死性的攻擊。在脫顆粒過程中釋放許多大分子物質，其中最主要的為granzyme B，檢測T細胞granzyme B分子的表達可以直接反映T細胞的殺傷力［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA作用后，T細胞內以及HepG2細胞內granzyme B均較對照組明顯升高(P＜0.05)，表明DHA通過活化T細胞，上調granzyme B的表達，從而在機體內間接增強誘導HepG2凋亡。而在T細胞的增殖活化過程中，ERK1/2信號通路扮演著重要角色。DHA是否通過抑制ERK1/2信號通路，有待進一步研究。

總之，在Et-DHA誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的過程中，caspase-9以及granzyme B扮演了重要角色。本研究的結果將為臨床上利用n-3多不飽和脂肪酸預防及輔助治療人類肝癌提供一定依據(jù)，無論單獨使用或是結合化療藥物聯(lián)合輔助使用都可能是一種高效、對正常細胞無毒性、安全的肝癌病人的生物預防和治療策略。

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Et-DHA induces apoptosis of HepG2 cells through activation of mitochondrial pathway and induction of granzyme B expression in T cells

CHEN Kun1，CHEN Yong-shun1，WANG Xue-jun1，CHEN Yun-fan1，LIU Ke-li1，CHEN Feng-jia2，LU Jian-jun2

(1Institute of Gene Interference，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China;2Department of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:kchennju@hotmail.com)

AIM:To investigate the effect of ethyl docosahexaenoate(Et-DHA)on the apoptosis of human hepatocarcinoma HepG2 cells.METHODS:HepG2 cells were used to test the anticarcinogenicity of Et-DHA.The direct inhibition of HepG2 cells by Et-DHA was detected by MTT.Nuclear morphological features of the HepG2 cells were observed under fluorescence microscope after staining with Hochest 33258.The levels of Bax，Bak，Bid，Bcl-2，Smac and cytochrome C(Cyt C)in mitochondria and cytosol，the cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，and cleaved caspase-3 in cytosol，as well as the release of reactive oxygen species(ROS)，total superoxide dismutase(SOD)and caspase-9 activity in the Et-DHA-treated HepG2 cells were determined by Western blotting and ELISA.Furthermore，by co-culturing the HepG2 cells with T cells，the effects of proliferation of Et-DHA-treated T cells on the activity of HepG2 cells were observed，and the level of granzyme B was detected.RESULTS:Et-DHA significantly inhibited the growth of HepG2 cells ina concentration-and time-dependent manner.The ROS release and caspase-9 activity increased markedly in Et-DHA-treated HepG2 cells，and no significant change of the total SOD activity was observed.The levels of the pro-apoptotic proteins Bax，Bak and Bid in mitochondria increased，the anti-apoptotic protein Bcl-2 as well as mitochondrial Cyt C and Smac levels decreased，and the cytoplasmic Cyt C，Smac，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3 and cleaved Bid levels showed dose-dependent increases.Additionally，the degree of Et-DHA-induced apoptosis in HepG2 cells in the co-culture group(T cells+HepG2 cells)showed a further increase as compared with the HepG2 cells treated with Et-DHA alone.Due to Et-DHA inducing elevation of granzyme B level in the T cells，the granzyme B released into HepG2 cells was significantly increased.CONCLUSION:Et-DHA might induce the apoptosis of HepG2 cells through activation of caspase-3 mainly via a mitochondrial intrinsic pathway and a caspase-8 pathway，and promote the increase in granzyme B indirectly by activating T cells，thus enhancing the cytotoxic effect on HepG2 cells.

Docosahexaenoic acids;HepG2 cells;Caspase-9;Granzyme B;Cytochrome C;Smac protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.001

1000-4718(2014)03-0385-09

2013-11-15

2014-01-20

國家自然科學基金資助項目(No.31171281);廣州市教育局科技計劃項目(No.10A044)

△通訊作者Tel:020-87755766;E-mail:kchennju@hotmail.com