DC－CIK細胞免疫療法對卵巢癌患者免疫功能的影響及臨床意義

李新迪，孟凡旭，王 欣，劉 念，劉林林

DC－CIK細胞免疫療法對卵巢癌患者免疫功能的影響及臨床意義

李新迪，孟凡旭，王 欣，劉 念，劉林林＊

（吉林大學第二醫院放療科，吉林長春130041）

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，在我國，卵巢癌的死亡率高居婦科惡性腫瘤的首位，嚴重影響著女性的生命健康及生活質量，因而一直受到人們的關注。卵巢癌的治療原則為手術、鉑類為基礎的聯合化療及放療，但卵巢癌患者術后放化療療效并不十分明顯，且容易復發和轉移。

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）聯合細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cell，CIK）過繼性免疫治療惡性腫瘤是一種新興的免疫治療手段，能有效抑制和殺滅腫瘤細胞且無明顯不良反應，降低腫瘤復發及轉移風險，提高患者的自身免疫力及生活質量，而且其安全性得到了廣泛認可［1－6］。近年隨著基礎科學研究的不斷進展，卵巢癌過繼性細胞免疫治療研究成為熱點，它作為繼手術、化療、放療等傳統療法之后的第四種治療手段，患者沒有明顯的毒副反應，耐受性更好，生活質量的改善明顯提高，在腫瘤的治療中發揮著越來越重要的作用。本研究通過檢測卵巢癌患者DC－CIK細胞免疫治療前后外周血T淋巴細胞亞群變化及相關細胞因子變化，觀察DC－CIK細胞回輸對卵巢癌患者免疫功能的影響，為進一步闡明機制及優化臨床應用進行初步探討。

1 資料與方法

1．1 研究對象 入選標準及對象：收集2009年3月－2012年3月就診于吉林大學白求恩第二醫院腫瘤生物治療中心單純行DC－CIK細胞免疫治療的卵巢癌患者22例，所有患者行DC－CIK細胞免疫治療時間至少為末次治療（手術、放療或化療）后8周，既往未接受過細胞免疫治療；患者KPS評分≥60分，預期生存＞3個月；同時排除其他系統和器官的惡性腫瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫病及糖尿病等疾病，見表1。

表1 22例卵巢癌患者臨床資料［n（%）］

患者排除標準：心、肝、腎功能不全；并發其他惡性腫瘤；有精神或心理疾病不能配合治療及療效評估者。

1．2 主要儀器與試劑

血細胞分離機（德國Kabi Fresenius公司），Ficoll－Hypaque（美國Gibco公司），FC500流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），抗人IL－2、INF－γ、TNF－αELISA試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司），酶聯免疫酶標儀（美國Themro公司）。

1．3 DC－CIK細胞的制備，參照文獻［7］

1．4 治療方法

對入組患者詳細了解病史，22例患者中漿液性癌17例，黏液性癌5例。Ⅰ期4例，Ⅱ期5例、Ⅲ期8例、Ⅳ期5例，患者年齡（60－76）歲，中位年齡65歲。全部患者距末次治療（手術或放、化療）均超過8周，KPS評分≥60分，預期生存＞3個月。

入組患者每周期治療前7天采集外周血單個核細胞，細胞于實驗室進行培養，第8天開始行DCCIK細胞回輸（1×109CIK及1×107DC細胞用0．9%生理鹽水100ml制成懸液，靜脈輸注，1h內輸完，交替輸注一次共7次）。所有患者均為4－6周行1次DC－CIK細胞免疫治療，每名患者共行7周期治療。輸注細胞過程中密切監測患者生命體征，隨訪48h觀察患者的短期不良反應。

1．5 樣品采集

分別于第1周期單個核細胞采集當天、第3、第7周期治療結束后第7天采集患者外周血，分別用CD3、CD4、CD8、CD56進行熒光標記，進行T細胞亞群的檢測。

1．6 細胞因子測定

采用ELISA法檢測患者血清TNF－α、IL－2、INF－γ的表達水平，按試劑盒說明書操作。

1．7 統計學方法

采用SPSS 11．0統計軟件處理，數據采用_x±s表示，各組樣本治療前后采用配對t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 治療前后患者外周血T淋巴細胞亞群變化

在治療前和第3、第7療程結束后第7天分別抽取患者外周血，用美國Beckman Coulter公司FC500流式細胞儀，檢測患者外周血T細胞亞群：總T淋巴細胞（CD3＋）、T輔助細胞（CD3＋／CD4＋）、T抑制細胞（CD3＋／CD8＋）、免疫狀態（CD4＋／CD8＋）、自然殺傷細胞（NK細胞）（CD3－／CD16＋56＋）、NKT細胞（CD3＋／CD16＋56＋）。

經統計分析，治療后患者T淋巴細胞亞群有增高趨勢，其中輔助性T細胞亞群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT細胞亞群（CD3＋／CD16＋56＋）較治療前提高幅度較明顯，但無統計學差異（P＞0．05），見表2。

表2 患者外周血T細胞亞群表型變化（_x±s，%）

2．2 治療前后患者細胞因子表達水平變化

如表3所示，患者外周血細胞因子IL－2、TNF－α、IFN－γ經3周期及7周期治療后復查均較治療前升高，其中7周期后復查有顯著差異（P＜0．05）。

表3 患者治療后CD4＋T細胞中相關細胞因子變化情況（_x±s，ng／L）

2．3 耐受性評估

患者經DC－CIK細胞免疫治療后，食欲不振、疲倦乏力、失眠盜汗、情緒低落等方面明顯改善。

患者治療過程中，監測內容包括變態反應、血液系統、心血管系統、肝臟、腎臟、胃腸道、全身癥狀等。結果顯示，在22例患者，共計154療程的治療過程中，5人次出現一過性發熱，體溫波動在37－39℃之間，經退熱對癥處理后緩解；2人次出現皮疹，經脫敏對癥處理后消褪；3人次出現一過性心慌，但不排除輸注速度過快引起。1人次出現轉氨酶的升高，經對癥治療后降至正常；其他患者未出現發熱、肝、腎功能異常、心臟不適和皮疹等副反應。見表4。

表4 DC－CIK細胞免疫治療后的不良反應（n）

3 討論

腫瘤免疫主要依賴細胞免疫，機體依賴完整的免疫機制來有效地監視和排斥癌變細胞，但癌變細胞因某些原因逃避免疫的監視排斥而增殖到一定程度時，腫瘤的發生便不可避免。因而機體細胞免疫功能的低下往往是腫瘤難以治愈和容易復發轉移的重要原因。腫瘤的免疫治療正是針對患者機體免疫力低下，針對性治療腫瘤的手段，是繼手術、化療、放療后腫瘤治療的第4種模式。而過繼性細胞免疫治療是腫瘤生物免疫治療中的重要手段，其宗旨在于通過提高機體的腫瘤抗原識別能力和免疫介導的腫瘤殺傷能力，從而打破患者的免疫耐受和免疫抑制狀態，起到延緩或減少腫瘤復發，提高腫瘤的治愈率和患者生存率的作用［8］。

DC和CIK是目前腫瘤過繼性細胞免疫治療中應用較為廣泛的細胞。DC發現于1973年，是目前發現功能最強大的專職性抗原提呈細胞，能夠攝取并識別腫瘤相關抗原，再將抗原遞呈給T淋巴細胞，有效誘導初始及靜息的T淋巴細胞增值和應答［9］，在機體的免疫應答以及抗腫瘤免疫反應中發揮著重要作用。CIK是迄今發現的所有免疫效應細胞中，增殖能力最強、細胞毒活性較強的細胞，其具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，同時還具有NK細胞非MHC限制性的抗腫瘤活性。DC、CIK二種細胞的聯合應用，確保了一個高效的免疫反應［10］，有效的殺傷腫瘤［11］。其主要機制目前認為主要有以下3個方面［12－14］：①通過不同的機制識別腫瘤細胞后，釋放穿孔素、顆粒酶等毒性顆粒，直接裂解腫瘤細胞。②可以釋放大量具有抑（殺）瘤活性的細胞因子，如IFN－γ、IL－2、INF－α，從而直接抑制腫瘤細胞并通過調節機體免疫反應性對腫瘤細胞進行殺傷。③CIK細胞還可以通過表達II型跨膜糖蛋白誘導腫瘤細胞凋亡。CIK細胞免疫治療惡性腫瘤在國內很多醫院已經開展，以CIK細胞為基礎的過繼性免疫治療是近幾年腫瘤生物免疫治療領域的熱點和焦點，并于胃腸道惡性腫瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤病例中得到研究應用，取得了顯著的療效。但眾所周知，抗腫瘤的細胞免疫是一個相當復雜的過程，T細胞亞群數量及相應細胞因子的變化的動態觀測可為過繼療法的優化應用及機制探討提供重要的基礎數據。

本研究通過對卵巢癌患者外周血淋巴細胞亞群及相關細胞因子的分析發現，DC－CIK細胞免疫治療后，患者外周血輔助性T細胞亞群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT細胞亞群（CD3＋／CD16＋56＋）與治療前相比，均有所升高，但無顯著統計學差異（P＞0．05），CD3＋／CD4＋、CD4＋／CD8＋、CD3＋／CD16＋56＋比值增加表明機體細胞免疫功能增強，提示DC－CIK細胞治療能增強機體的免疫功能，患者免疫抑制狀態得到了最大程度地改善，進一步殺傷腫瘤細胞。

正常的生理情況下，Th1、Th2兩類輔助性Th細胞處于相互抑制、相互轉化的平衡狀態，一旦平衡被打破，機體就會處于Th1優勢或Th2優勢的漂移狀態，從而出現各種病理反應。卵巢癌患者處于免疫抑制狀態，免疫功能越低，漂移越強［15］，在抗腫瘤免疫中，Th1類細胞因子應具有更重要的作用，有報道稱［16］，腫瘤患者Th2較Th1相對存在優勢，這可能與腫瘤免疫的抑制相關。Th1細胞主要分泌IL－2、IFN－γ、TNF－α和TNF－β。CIK可特異地聚集于腫瘤局部發揮靶向抗腫瘤作用；分泌大量的Th1類細胞因子［17］，有研究顯示，DC－CIK聯合治療可增加IFN－γ的表達，進一步增強抗腫瘤作用。本研究結果提示，患者外周血IL－2、TNF－α、IFN－γ水平較治療前提高且差異均有統計學意義（P＜0．05），提示DC－CIK細胞免疫治療有助于患者機體Th1免疫增強，提高機體抗腫瘤能力。有研究顯示，DC的CD40可以和CIK細胞表面的CD40配體接觸并相互作用，從而促進DC共刺激分子和特異性分子的表達，使DC分泌的細胞因子（如IL－2、IL－12、IFN－γ等）明顯增多，刺激CIK 細胞的增殖活性［18，19］，促進CIK細胞成熟，而CIK細胞活化后可以產生大量的炎癥細胞因子，如IL－2、IFN－γ、TNF－α等，進一步抑制腫瘤、殺傷腫瘤細胞。同時值得注意的是，一些表面標志物與患者預后密切相關，其可能同樣在免疫治療療效發揮中起到了關鍵作用，并有可能是未來過繼性免疫治療的發展方向［20，21］。

綜上所述，DC－CIK細胞治療能有效地提高卵巢癌患者的T淋巴細胞免疫能力并增強Th1類細胞因子抗腫瘤作用，有效提高患者生存質量，且安全性良好。隨著細胞免疫學、分子生物學及基因工程技術的發展，相信過繼性細胞免疫治療將在抗腫瘤治療中發揮更大的作用。

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李新迪（1987－），男，在讀碩士，主要從事腫瘤的基因和免疫治療研究。

2013－01－21）

1007－4287（2014）02－0283－04

＊通訊作者