血清her－2ECD和cox－2水平與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的關系

陳為軍，仲昭坤，張恩寧，周冬梅，宮新玲

血清her－2ECD和cox－2水平與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的關系

陳為軍＊，仲昭坤，張恩寧，周冬梅，宮新玲

（煙臺市煙臺山醫院南院腫瘤內科二病區，山東煙臺264000）

目的 探討血清her－2和cox－2濃度與非小細胞肺癌（NSCLC）患者臨床病理特征和長期預后之間的關系。方法 采用ELISA法檢測非小細胞肺癌組221例，肺部良性疾病組41例血清中her－2和cox－2濃度，比較不同患者血清her－2和cox－2濃度差異，探討兩者的相關性及對預后的影響。結果 her－2和cox－2在非小細胞肺癌患者血清水平明顯高于肺部良性疾病患者，差異均有統計學意義（P＜0．05）；且均與腫瘤分期呈正相關（Spearman秩相關系數r分別為：0．830，0．719，P＜0．05）。單因素分析顯示血清her－2和cox－2濃度的表達均與患者生存有密切關系（P＜0．05）；多因素分析顯示血清her－2和cox－2濃度均不是影響預后的獨立危險因素，而兩者聯合檢測可預測病人的預后相對危險度為1．5（1．08－2．09）。結論 非小細胞肺癌患者血清中her－2和cox－2陽性表達明顯相關。兩者的聯合檢測有助于非小細胞肺癌的預后評估。

非小細胞肺癌；her－2；cox－2；ELISA

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0227）

我國城市中肺癌病死率位居惡性腫瘤之首，非小細胞肺癌占肺癌發病率的80%，近年來對非小細胞肺癌的分子生物學的研究越來越深入。Her－2在NSCLC的表達率為16%－57%，部分研究結果顯示her－2的高表達與NSCLC的預后相關，外周血可測得her－2胞外域蛋白（ECD）［1］。Cox－2是近年被關注的腫瘤靶點，在多種腫瘤包括NSCLC高表達，有研究結果提示高表達與預后差相關，但結論不一［2］。其中兩者在非小細胞肺癌中的研究多集中于免疫組化層面，而采用血清進行研究的卻鮮有報道，兩者均可在外周血中測得，本研究采用ELISA法定量檢測非小細胞肺癌患者治療前血清her－2與cox－2水平，觀察治療前血清中兩者的水平是否可判斷病人的預后，進一步驗證兩者在血清中表達是否具有相關性。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

收集2008年1月至2009年12月在山東省煙臺市煙臺山醫院腫瘤內科住院的非小細胞肺癌患者共221例，入組之前未經過任何治療，詳細記錄年齡、分期、相關化驗指標等臨床資料。選取41例肺部良性疾病作為對照組，其中肺部感染性疾病6例，慢性阻塞性肺疾病19例，支氣管哮喘16例。隨訪截止日期為2012年12月，中位隨訪時間為3年零7個月。

1．2 樣本采集及保存

非小細胞肺癌組及對照組均于治療前清晨抽取空腹靜脈血，均為一式三份，3 000r／min離心10 min，取上層血清存于－20℃冷凍保存備用。

1．3 試劑和方法

采用雙抗體夾心ELISA法檢測兩者在血清中的濃度，試劑盒均購自美國ADL公司，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1．4 判定標準

血清her－2及cox－2陽性判定標準：以血清her－2／neu濃度≥15ng／ml為陽性，＜15ng／ml為陰性；cox－2≥11．90ng／ml為陽性，＜11．90ng／ml為陰性。兩者陽性值均為正常值上限。

1．5 統計學處理

用SPSS13．0進行統計學分析，使用Kaplan–Meier法進行生存分析，使用Wilcoxon秩和檢驗和log－rank檢驗進行單因素分析，使用Cox回歸模型進行多因素分析。定量資料采用_x±s表示，兩變量相關關系采用Pearson相關分析，與腫瘤分期的關系采用Spearman秩相關分析，檢驗水準α＝0．05。

2 結果

2．1 單因素分析

病人的臨床資料及單因素分析結果詳細總結于表1。

采用Wilcoxon秩和檢驗對入組病人進行單因素分析（見表1），發現有以下臨床特點的病人生存期相對較短（P＜0．05）：ECOG評分≥2分；腫瘤大小及局部浸潤范圍分期為T3－T4；淋巴結受累情況分期為N1－N3；存在遠處轉移者；血清白細胞計數＞10＊109者；血清her－2／neu濃度≥15ng／ml者；血清cox－2≥11．90ng／ml者。由此可認為血清her－2和cox－2濃度的表達均與患者生存有密切關系。

log－rank檢驗不同濃度her－2和cox－2患者的生存率曲線分布差別有統計學意義，χ2＝18．41，P＝0．004；χ2＝10．31，P＝0．01；顯示根據治療前血清her－2繪制的生存概率見圖1，顯示血清her－2陽性者預后差；根據治療前血清cox－2繪制的生存概率見圖2，顯示血清cox－2陽性者預后差。

表1 病人臨床資料及單因素分析

圖1 血清her－2分組的累計生存率曲線

2．2 多因素分析

圖2 血清cox－2分組的累計生存率曲線

多因素分析顯示，以下臨床特點為獨立的預后不良因素（相對危險度及95%可信區間）：ECOG評分≥2分：2．28（1．59－3．27）；有淋巴結受累者2．0（1．38－2．99）；存在遠處轉移者1．48（1．04－2．09）。血清her－2與cox－2水平均不能單獨成為非小細胞肺癌的獨立預后因素，而兩者聯合檢測可預測病人的預后1．5（1．08－2．09）

2．3 血清her－2與cox－2水平（見表2）

2．3．1 血清her－2與cox－2水平：Wilcoxon秩和檢驗發現兩者在非小細胞肺癌組水平均高于肺部良性病變組，差異均有統計學意義（P＜0．05）；進一步亞組分析提示兩者與腫瘤分期呈正相關（Spearman秩相關系數r分別為：0．830，0．719，P＜0．05）。

表2 兩組Her－2、Cox－2水平比較

2．3．2 非小細胞肺癌組血清her－2與cox－2水平的關系：呈正相關關系，Pearson相關系數r＝0．717，P＜0．05。

3 討論

既往關于her－2和cox－2的研究大多依賴于組織標本或細胞系，臨床應用具有一定限制，本研究應用ELISA法定量檢測非小細胞肺癌患者化療前血清her－2與cox－2水平，該方法簡便易行，患者容易接受，臨床可操作性強，可以方便快捷地對非手術病人進行有效地評估及監測，為相應的靶向治療提供依據，而且便于基層醫院開展。

her－2／neu基因是人類表皮生長因子受體（EGFR）家族的第2個成員，定位于人染色體17q21，包括信號肽、胞外區、胞漿區和跨膜區，其中胞外區（extra－cellular domain，ECD）相對分子質量為（97－115）×103kD，可被基質金屬蛋白酶切割進入外周血［3］。her－2在正常情況下處于非激活狀態，與其特異性抗體結合后可調節細胞的分裂、分化和增殖，當受到某些致癌因素的作用后，其結構或表達調控失常，轉而具有腫瘤轉化活性，可促使細胞發生惡性轉化，并通過阻止腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤新生血管的生成等途徑促進腫瘤細胞的生長及轉移［4－5］。her－2癌基因擴增或蛋白過量表達，可見于人類大部分腫瘤組織中［5，6］。既往研究多集中于免疫組化層面，在非小細胞肺癌中血清her－2的研究鮮有報道，有研究［7］表明，正常人群血清中存在由細胞表面脫落的her－2／neu的細胞外區ECD片段，但水平較低（＜15ng／ml）；國內外、相關研究顯示血清her－2含量與免疫組化監測癌組織中her－2／neu的表達水平呈正相關［8－10］。本實驗發現，約有20%的非小細胞肺癌患者血清her－2呈陽性表達，且與TNM分期呈正相關，對病人進行隨訪發現該部分患者預后較差，這與目前大部分在免疫組化層面的研究結果一致［11，12］。

環氧化酶－2（Cyclooxygenase－2，cox－2）的基因為誘導表達型基因，在正常組織中多不表達或低表達，但在炎癥、腫瘤等情況下，細胞受誘導而大量表達cox－2。目前研究表明，在絕大多數腫瘤組織中均有cox－2表達，其主要通過影響腫瘤細胞的增殖與分化、抑制腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期、促進腫瘤血管生成等多個途徑在腫瘤的發生發展、侵襲轉移過程中起著重要作用［13－15］。文獻顯示，在幾乎所有NSCLC均表達cox－2，并呈廣泛的中等強度表達［15］，其陽性表達率又以腺癌最高［14］，同時與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移等密切相關［16－18］。同樣，既往研究多集中于免疫組化層面，近年來相關研究提示，血清cox－2表達情況與肺癌組織中cox－2表達情況呈正相關［19］。本實驗發現非小細胞肺癌患者血清中cox－2表達陽性率為53．8%，進一步亞組分析提示在Ⅰ、Ⅱ期患者中血清cox－2表達量與對照組比較有顯著差異，說明cox－2是肺癌發生的早期事件。同時，在Ⅲ＋Ⅳ期患者高于I＋Ⅱ期患者，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組。以上均說明cox－2表達與TNM分期、轉移正相關。同樣，對病人進行隨訪發現，血清cox－2表達陽性的非小細胞肺癌病人預后較差。

在免疫組化層面，國內外已有多項研究證實兩者為非小細胞肺癌的預后因素，同時證實兩者之間存在相關性。目前研究認為，her－2與cox－2兩條通路之間存在交叉和相互作用，her－2可上調血管內皮生長因子（VEGF）及血管通透因子的表達，促進腫瘤新生血管的生成，而由cox－2催化合成的前列腺素本身就是一種血管通透因子，可能作為血管生成劑促進腫瘤的形成。Benoit等［20］發現her－2可通過不同的機制來誘導cox－2的轉錄，her－2狀態可能是cox－2表達的一個決定性因素，her－2可通過Ras—Raf—MEK—MAPK—AP一1／PEA3信號傳導通路，誘導cox－2的轉錄。同時，cox－2對her－2的表達還存在反向調節，cox－2及PGE2可能通過cAMP介導上調her－2的表達。本實驗提示，NSCLC患者血清中her－2與cox－2陽性表達呈一致性，進一步驗證了上述各種研究結果，而且統計學分析提示兩者均不能單獨成為非小細胞肺癌的獨立預后因素，而兩者聯合檢測可預測病人的預后，提示在NSCLC中her－2與cox－2存在相互調控機制共同促進腫瘤的發生和發展。我們還發現在非小細胞肺癌患者血清中，her－2與cox－2皆為陽性者比兩者皆為陰性者，臨床分期晚、淋巴結轉移率高；同時，對入組病人進行隨訪發現：her－2與cox－2皆陽性表達病人，無論是否發生淋巴結轉移，生存率都差，提示her－2與cox－2共同作用可能會誘導轉移，影響預后。以上分析提示，在NSCLC患者血清中her－2與cox－2皆為陽性者預后差。因此，結合本實驗結果我們推測her－2與cox－2抑制劑聯合使用可能使此類人群獲益。

綜上所述，通過ELISA法檢測血清her－2與cox－2水平，可以方便快捷的對非小細胞肺癌病人進行評估及監測，具有取材簡便，操作簡單，便于基層醫院開展等優點，有可能通過動態觀察指標變化來早期發現疾病進展，間接判定療效、預后等。同時ELISA法客觀性較強，也可為her－2與cox－2的靶向治療提供依據，指導臨床治療。隨著科技的不斷發展，相信應用ELISA法對血清中her－2與cox－2的濃度進行聯合檢測將為腫瘤研究及臨床治療開辟新徑。

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Serum levels of her－2 and cox－2in patients with non－small cell lung cancer and the clinical significance

CHEN Wei－jun，ZHONG Zhao－kun，ZHANG En－ning，et al．
（The Second Ward Section，Department of Medical Oncology，Yantaishan Hospital，Yantai 264000，China）

Objective To investigate the correlations of serum her－2and cox－2levels with clinical pathological characteristics and Long－term prognosis in patients with non－small cell lung cancer（NSCLC）．Methods Enzyme－linked immunoadsorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of her－2and cox－2in the serum samples collected from 221 NSCLC patients and 41controls．The concentrations of her－2and cox－2were compared between different patients，and there correlations as well as their influences on prognosis were also analyzed．Results The levels of serum her－2and cox－2were significantly higher in the NSCLC patients than those in the controls（P＜0．05），which were also positively correlated tumor stages（Spearman＇s rank correlation coefficient r：0．830，0．719，P＜0．05）．Univariate analysis showed that serum concentrations of both her－2and cox－2expression were closely correlated with survivals of the patients（P＜0．05）．Multi－factor analysis showed that both her－2and cox－2concentrations in the serum were not independent risk factors influencing prognosis，but their combination can predict the prognosis of patients 1．5（1．08－2．09）．Conclusion Serum levels of her－2and cox－2expression are significantly correlated in NSCLC patients，and combined detection for their expression may be of important value in judgment of prognosis．

non－small cell lung cancer；her－2；cox－2；ELISA

R734．2

A

陳為軍，男，32歲，碩士，主治醫師，研究方向：肺癌的綜合治療。

2013－04－10）

1007－4287（2014）02－0227－04

煙臺市科學技術發展計劃項目（項目編號：2009156－3）

＊通訊作者