DNA－PK基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

趙 靜，陳 珂

DNA－PK基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

趙 靜，陳 珂＊

（南京明基醫(yī)院南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南京210000）

目的 探討DNA－PK基因?qū)Τ聊殉舶┘?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法 DNA－PK shRNA以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株Skov3，24h后接受2Gy X射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，標(biāo)記AnnexinⅤ／PI，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)，RT－PCR檢測(cè)p53和p21mRNA的表達(dá)量。結(jié)果 2Gy輻射引起2．40%±1．53%Skov3細(xì)胞凋亡，高于對(duì)照組（t＝2．618，P＝0．026），而轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA的Skov3細(xì)胞經(jīng)2Gy照射，凋亡細(xì)胞為18．74%±4．15%，明顯高于單純2Gy照射組（t＝9．052，P＜0．001）及DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染組（2．77%±1．73%）（t＝8．869，P＜0．001）。RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，2Gy照射組，Skov3細(xì)胞p53mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，而DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染的Skov3細(xì)胞接受2Gy照射，其p53mRNA表達(dá)量降低，接近正常水平，單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA組p53mRNA表達(dá)量無明顯變化。轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA的Skov3細(xì)胞經(jīng)2Gy照射，其p21mRNA表達(dá)量低于2Gy照射組接近正常組水平，單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA組Skov3細(xì)胞p21mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相當(dāng)。結(jié)論DNA－PK shRNA可增加輻射后巢癌細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制是通過下調(diào)p53和p21mRNA表達(dá)，而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。

DNA－PK；干擾RNA；卵巢癌細(xì)胞Skov3；輻射損傷；DNA損傷

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0200）

卵巢癌是婦科中致死率高、發(fā)病率高的惡性腫瘤，對(duì)放化療不敏感。這也是臨床腫瘤治療實(shí)踐及目前研究的熱點(diǎn)問題。

細(xì)胞受到射線照射后會(huì)產(chǎn)生DNA損傷，損傷的DNA激活損傷應(yīng)答激酶ATM、ATR，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期檢查，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，修復(fù)損傷的DNA。DNA－PK是DNA損傷識(shí)別與修復(fù)的關(guān)鍵酶，決定受損細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸［1］。可見DNA損傷修復(fù)應(yīng)答是細(xì)胞放化療抵抗的重要原因。因此本文擬以輻射作為損傷手段，制備細(xì)胞DNA損傷模型，干擾DNA損傷識(shí)別、修復(fù)關(guān)鍵酶DNA－PK，試圖探討DNA－PK對(duì)放射損傷的Skov3細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，為臨床卵巢癌臨床治療的新方法新藥物開發(fā)提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法：

1．1 主要試劑和儀器

DMEM、LipofectimineTM2000，Invitrogen公司；小牛血清，Hyclone公司；胰酶、DEPC，Sigma公司；AnnexinⅤ／PI，碧云天生物技術(shù)研究所；TRIzaol，Invitrogen公司；Sensiscript RT Kit，QIAGEN公司；DNA marker DL2000，寶生物工程（大連）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；卵巢癌細(xì)胞株Skov3，本室保存；DNA－PK shRNA，本室構(gòu)建。FACScan流式細(xì)胞儀，BD公司；飛利浦深部X射線治療機(jī)，Philips；PCR儀，ABI；凝膠成像系統(tǒng)，Bio Rad。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)及shRNA轉(zhuǎn)染 Skov3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，DMEM，加10%小牛血清、青霉素100U／ml、鏈霉素100μg／ml。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。DNA－PK shRNA以脂質(zhì)體LipofectimineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Skov3細(xì)胞株，質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為2 μg∶5μl。具體操作按說明書進(jìn)行。

1．2．2 照射 收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種6孔培養(yǎng)板，每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞，第二天采用深部X射線治療機(jī)進(jìn)行照射，電壓200kV，電流10mA，濾板0．5 mm Cu和1．0mm Al。球靶距50cm，劑量率0．287Gy／min。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)分析DNA－PK shRNA對(duì)Skov3細(xì)胞2Gy照射誘導(dǎo)凋亡的影響

DNA－PK shRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24h，照射2Gy，繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別收集各組細(xì)胞，標(biāo)記AnnexinⅤ／PI，流式細(xì)胞術(shù)分析其凋亡。

1．2．4 RT－PCR檢測(cè)DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞p53和p21表達(dá)量的變化

收集細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol提取RNA，按Sensiscript RT Kit試劑盒說明進(jìn)行RT－PCR。1．2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS14進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2．1 DNA－PK shRNA對(duì)2Gy輻射誘導(dǎo)Skov3細(xì)胞凋亡的影響

2Gy輻射引起2．40%±1．53%Skov3細(xì)胞凋亡，高于對(duì)照組（t＝2．618，P＝0．026），而轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA的Skov3細(xì)胞經(jīng)2Gy照射，凋亡細(xì)胞為18．74%±4．15%，明顯高于單純2Gy照射組（t＝9．052，P＜0．001）及DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染組（2．77%±1．73%）（t＝8．869，P＜0．001）（表1）。

表1 DNA－PK shRNA對(duì)2Gy輻射誘導(dǎo)Skov3細(xì)胞凋亡的影響

2．2 RT－PCR檢測(cè)DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞p53和p21表達(dá)量的變化

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，2Gy照射組，Skov3細(xì)胞p53mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，而DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染的Skov3細(xì)胞接受2Gy照射，其p53 mRNA表達(dá)量降低，接近正常水平，單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA組p53mRNA表達(dá)量無明顯變化，接近正常組水平（圖1a）。轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA的Skov3細(xì)胞經(jīng)2Gy照射，其p21mRNA表達(dá)量低于2Gy照射組接近正常組水平，單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA組Skov3細(xì)胞p21mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相當(dāng)（圖1b）。

圖1 RT－PCR檢測(cè)DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞p53和p21表達(dá)量的變化

3 討論

卵巢癌臨床治療的難題是其對(duì)放化療具有抵抗性，而影響疾病的轉(zhuǎn)歸。放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)主要是造成腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，而細(xì)胞具有DNA損傷修復(fù)能力［2－4］。當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)被激活［5］，指導(dǎo)周期特異性修復(fù)機(jī)制（HR和NHEJ等）［6］。因此，如果能有效的干擾細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和修復(fù)系統(tǒng)，則可以誘使大量的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。

在DNA損傷修復(fù)中DNA－PK是關(guān)鍵酶。為此，本文應(yīng)用放射方法，體外建立細(xì)胞DNA損傷模型，干擾DNA－PK沉默其表達(dá)，觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞Skov3凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA的Skov3細(xì)胞經(jīng)2Gy照射，凋亡細(xì)胞為18．74%±4．15%，明顯高于單純2Gy照射組（2．40%±1．53%）（t＝9．052，P＜0．001）及DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染組（2．77%±1．73%）（t＝8．869，P＜0．001）。表明DNA－PK shRNA可提高輻射誘導(dǎo)的Skov3細(xì)胞凋亡。

如果修復(fù)失敗，檢查點(diǎn)通過啟動(dòng)p53－依賴或p53－非依賴途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在本研究中DNA－PK shRNA轉(zhuǎn)染的Skov3細(xì)胞接受2Gy照射，與單純2Gy照射組對(duì)比其p53mRNA表達(dá)量下降，減少其下游p21轉(zhuǎn)錄，使其mRNA表達(dá)量下降，致使Cdk2－cyclinE復(fù)合物活性增加，解除細(xì)胞周期阻滯，增加細(xì)胞凋亡。提示干擾DNA－PK，通過下調(diào)p53和p21mRNA表達(dá)量，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，從而增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示在臨床卵巢癌治療時(shí)短期大劑量照射，降低腫瘤細(xì)胞修復(fù)后的增殖機(jī)會(huì)，可提高治療效果。

［1］Chapman JR，Taylor MR，Boulton SJ．Playing the end game：DNA double－strand break repair pathway choice［J］．Mol Cell，2012，47（4）：497．

［2］Kinsella TJ．Understanding DNA damage response and DNA repair pathways：applications to more targeted cancer therapeutics［J］．Semin Oncol，2009，36（2Suppl 1）：S42．

［3］Smith J，Tho LM，Xu N，et al．The ATM－Chk2and ATR－Chk1 pathways in DNA damage signaling and cancer［J］．Adv Cancer Res，2010，108：73．

［4］Deckbar D，Jeggo PA，L？brich M．Understanding the limitations of radiation－induced cell cycle checkpoints［J］．Crit Rev Biochem Mol Biol，2011，46（4）：271．

［5］Lossaint G，Besnard E，F(xiàn)isher D，et al．Chk1is dispensable for G2 arrest in response to sustained DNA damage when the ATM／p53／p21pathway is functional［J］．Oncogene，2011，30（41）：4261．

［6］Landsverk KS，Patzke S，Rein ID，et al．Three independent mechanisms for arrest in G2after ionizing radiation［J］．Cell Cycle，2011，10（5）：819．

The effects of DNA－PK gene silencing to cell apoptosis on ovarian cancer

ZHANG Jing，CHEN Ke．
（Affiliated Hos－pital of Nanjing Medical University，Nanjing Mingji Hospital，Obstetrics and Gynecology，Nanjing210000，China）

Objective To explore the effects and mechanism that DNA－PK gene silencing to cell apoptosis on ovarian cancer cells．Methods Constructed DNA－PK shRNA and applied liposome－mediated transfection to ovarian cancer cells Skov3，after 20h，giving 2Gy X－ray irradiation and continued to train until 48h．Then the cells were collected，and AnnexinⅤ／PI was labeled，flow cytometry was applied to analyze the apoptosis of cells，while RT－PCR was used to detecte of p53and p21mRNA expression．Results After 2Gy radiation，2．40%±1．53%Skov3turn out cells apoptosis，higher than the control group，the differences were significant（t＝2．618，P＝0．026），and the Skov3cells were transfected DNA－PK shRNA that after 2Gy irradiation，apoptotic cells was 18．74%±4．15%，significantly higher than only 2Gy irradiation group（t＝9．052，P＜0．001）and single DNA－PK shRNA transfection group（2．77%± 1．73%），the differences were significant（t＝8．869，P＜0．001）．The results of RT－PCR showed that the mRNA expression of Skov3cells p53in 2Gy irradiation group was higher than the normal group，while the mRNA expression of p53in the DNA－PK shRNA transfected Skov3cells and received 2Gy irradiation group decreased to near normal levels，the mRNA expression of p53in single transfection DNA－PK shRNA group did not change．DNA－PK shRNA transfected Skov3cells were given 2Gy irradiation，the mRNA expression of p21levels was lower than the 2Gy irradiation group，and it’s close to the level of the normal group，the mRNA expression of p21in only DNA－PK shRNA transfected Skov3cells group is near the control group．Conclusion DNA－PK shRNA can increase ovarian cancer cell line apoptosis after radiation，and its possible mechanism is that the mRNA expression of p53and p21decreased and then initiate apoptosis．

DNA－PK；Interfering RNA；Ovarian cancer Skov3；Radiosensitization；DNA damage

R737．31

A

2013－01－25）

1007－4287（2014）02－0200－03

＊通訊作者