利魯唑片在犬體內的藥動學及體內外相關性研究

慕金超,劉春芬

(徐州工業職業技術學院,徐州 221140)

利魯唑片在犬體內的藥動學及體內外相關性研究

慕金超,劉春芬

(徐州工業職業技術學院,徐州 221140)

目的 研究利魯唑片(受試制劑)與利魯唑膠囊(參比制劑)在比格犬體內藥動學參數及利魯唑片體外釋放與體內吸收的相關性,計算利魯唑片的相對生物利用度。方法健康比格犬6只,分別灌服相當于利魯唑50 mg的利魯唑片和市售利魯唑膠囊,服藥后及間隔14 d交叉服藥后0～72 h內靜脈取血。用高效液相色譜法測定血漿中利魯唑濃度,房室模型計算其主要的藥動學參數,用Wanger-Nelson法對利魯唑片在犬體內外相關性進行評價。結果受試制劑與參比制劑的半衰期(t1/2)分別為(12.43±3.87)和(12.57±3.25)h,達峰時間(tmax)分別為(6.00±2.60)和(6.23± 2.72)h,峰濃度(Cmax)分別為(56.24±16.51)和(60.82±18.13)ng·mL-1,濃度-時間曲線下面積(AUC0-72)分別為(1 255.83±311.39)和(1 283.50±313.81)ng·mL-1·h,AUC0-∞分別為(1 282.57±322.64)和(1 297.22±297.39) ng·mL-1·h。膠囊劑對片劑的相對生物利用度為(105.9±30.6)%。結論HPLC法測定血中利魯唑濃度,雜質無干擾,重復性好,準確度高。利魯唑片在犬體內吸收度與參比制劑相當。利魯唑片體內外相關性良好。

利魯唑;藥動學;色譜法,高效液相

利魯唑片主要用于肌萎縮側索硬化癥患者的治療,可延長生存期和延緩呼吸功能障礙的發生[1]。筆者建立測定血中利魯唑濃度的高效液相色譜(HPLC)法,并采用該法考察利魯唑片(受試制劑)與利魯唑膠囊(參比制劑)在比格犬體內利魯唑的相對生物利用度與藥動學特性,為該制劑臨床應用提供參考。采用Wanger-Nelson法對利魯唑片在比格犬的體內外相關性進行評價。

1 材料與方法

1.1 動物 健康比格犬6只,雌雄各半,體質量10～12 kg,由揚州大學比格犬飼養基地提供,飼養于徐州醫學院實驗中心實驗動物房,實驗動物生產許可證號: SCXK(蘇)2010-0003,實驗動物質量合格證號: 20200601。實驗前禁食12 h。

1.2 藥品與試劑 利魯唑片(江蘇恩華藥業股份有限公司,批號:20120119,每片含利魯唑50 mg)；利魯唑膠囊(山東魯南貝特制藥有限公司,批號:120307,每粒含利魯唑50 mg)；利魯唑對照品(魯南制藥股份有限公司,批號:120318,標示量99.8%)；鹽酸氟西汀對照品(江蘇恩華藥業股份有限公司技術中心合成室精制,批號:20120125,標示量99.8%)；乙腈(色譜純,上海凌峰化學試劑有限公司),甲醇(色譜純,上海凌峰化學試劑有限公司)、乙酸銨(色譜純,TEDIA公司)；磷酸(分析純,無錫亞盛化工有限公司)；正己烷(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.3 實驗儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷侖公司,G1321熒光檢測器,G1310色譜泵)；HS色譜數據工作站(杭州英譜科技開發有限公司)；METTLERAG135雙量程電子天平(瑞士梅特勒有限公司)；TGir16B離心機(上海安亭科學儀器廠)；XW 80型旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)；pHS-4C型酸度計(成都市方舟科技開發公司)。

1.4 實驗設計與血樣采集 采用雙周期自身對照交叉實驗,將6只健康比格犬隨機分為A、B兩組,每組3只。兩組比格犬禁食12 h(自由飲水)后,分別灌服利魯唑片1片(每片按利魯唑計50 mg)或利魯唑膠囊1粒(每粒按利魯唑計50 mg),給藥后0,1,2,3,4,5,6, 7,8,10,12,16,24,48,72 h靜脈采血,間隔14 d后交叉服藥,同樣時間點靜脈采血。所采血樣用肝素抗凝,離心得血漿后,于-20℃冰箱保存。

1.5 血漿樣品濃度測定方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil BDSC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相:0.03 mol·L-1乙酸銨溶液(用磷酸調pH至3.5)-甲醇-乙腈(38∶20∶42)；流速:1 mL·min-1；熒光激發波長:232 nm；熒光發射波長:350 nm；進樣量:20 μL；柱溫:35℃[2-3]。

1.5.2 溶液的制備 取利魯唑對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并分別制成每毫升含利魯唑0.01, 0.02,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00,2.00 μg的溶液,作為對照品溶液。

取鹽酸氟西汀適量,精密稱定,加甲醇溶解并制成每毫升含鹽酸氟西汀約1.0 μg的溶液,作為內標溶液。

1.5.3 血漿樣品的處理 取血漿樣品1.0 mL,加入內標溶液10 μL和2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.1 mL,混勻,加正己烷3 mL,渦旋振蕩1 min, 3 000 r·min-1離心2 min,取有機層,于40℃水浴中用氮氣吹干,殘渣用流動相100 μL溶解,于3 000 r·min-1離心10 min,取上清液20 μL注入色譜儀。

1.5.4 專屬性實驗 取空白血漿,除不加入內標溶液外,其他按“1.5.2”項下操作。另取加入利魯唑對照品的血漿、灌服受試藥后6 h后的血漿各按“1.5.3”項下操作。驗證方法的專屬性。

1.5.5 線性范圍與檢測限 精密量取不同濃度的對照品溶液各100 μL,再加入空白血漿900 μL,配成濃度分別為每毫升含利魯唑1.0,2.0,5.0,10.0,21.0, 50.0,100.0,250.0 ng系列加標血樣,按“1.5.3”項下操作。以對照品的峰面積(AR)與內標的峰面積(AS)的比值(f=AR/AS)對濃度(C)作直線回歸。

1.5.6 回收率實驗 提取回收率實驗:取空白血漿900 μL,按“1.5.5”項下方法分別配制低、中、高3種濃度(分別為2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)的血漿樣品,每種濃度做5份樣品。除不加入內標溶液外,其他按“1.5.3”項下操作,記錄對照品峰面積,與相應濃度的對照品溶液直接進樣所得峰面積相比,即得。相對回收率實驗:取空白血漿900 μL,按“1.5.5”項下方法分別配制低、中、高3種濃度(分別為2.0,50.0, 200.0 ng·mL-1)的血漿樣品,每種濃度做5份樣品,按“1.5.3”項下操作,記錄對照品的峰面積(AR)與內標的峰面積(A)的比值(f),代入利魯唑標準曲線計算測得濃度,與實際加入對照溶液濃度相比,即得。

1.5.7 精密度實驗 照“1.5.2”項下方法制備血漿樣品,同法操作,記錄對照品和內標峰面積比值(f),日內重復測定5次,日間重復測定5 d。以考察日內變異和5 d內的日間變異。

1.5.8 凍融穩定性實驗 取空白血漿900 μL,按“1.5.5”項下方法分別配制低、中、高3種濃度(分別為2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)的血漿樣品,每種濃度做5份樣品,每種濃度樣品先測1份,其余放置-20℃冰箱冷藏,在1周內分4次測定。測定時于37℃水浴融解后,按“1.5.3”項下操作,測定血漿中利魯唑的峰面積。如此反復4次凍融。

1.6 數據處理與統計學方法 本實驗采用房室模型和統計矩模型來計算其主要的藥動學參數:血藥峰濃度(Cmax)、達峰時間(tmax)、藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)、平均駐留時間(mean retention time,MRT)及相對生物利用度等。利魯唑片和利魯唑膠囊各項藥動學參數均由DAS2.0版軟件進行計算,將所得單劑量給藥的Cmax、AUC0-∞、AUC0-T經對數轉換后進行方差分析,并進一步采用雙單側t檢驗和90%置信區間法進行生物等效性評價。tmax經非參數檢驗法(秩和檢驗)進行差別檢驗[4],以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿樣品濃度測定

2.1.1 專屬性實驗 空白血漿、加入對照物的血漿(對照品)、灌服受試藥后6 h后的血漿(樣品)色譜圖見圖1。圖1表明,在本實驗條件下,血漿中內源性物質不干擾樣品峰的測定,基線噪音小,利魯唑、內標的出峰時間依次為9.0與11.0 min,峰形尖銳,分離度好。表明本法具有良好的專屬性,在此條件下所測得的結果能準確反映利魯唑濃度。

2.1.2 線性范圍與檢測限 以對照品的峰面積(AR)與內標的峰面積(AS)的比值(f=AR/AS)對濃度(C)作直線回歸,得回歸方程:f=0.011 3C+0.004 82,r= 0.998 9。實驗表明,本方法的線性范圍為1.0～250.0 ng·mL-1。按上述條件測得利魯唑最低檢測限為0.3 ng·mL-1(以信噪比＞3計),定量限為1.0 ng·mL-1(以信噪比＞10計),RSD為4.6%。

2.1.3 回收率實驗

2.1.3.1 提取回收率實驗 記錄對照品峰面積,與相應濃度的對照品溶液直接進樣所得峰面積相比,結果低、中、高濃度(分別為2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)血漿樣品的平均提取回收率(n=5)分別為(104.4± 4.5)%,(93.2±9.7)%,(96.9±3.1)%,RSD分別為4.3%,10.4%與3.2%。

2.1.3.2 相對回收率實驗 記錄對照品的峰面積(AR)與內標的峰面積(AS)的比值(f),代入利魯唑標準曲線計算測得濃度,與實際加入對照溶液濃度相比,即得低、中、高3種濃度血漿樣品的平均相對回收率(n=5)分別為(101.0±9.6)%,(105.0±11.2)%,(97.1± 3.1)%,RSD分別為9.5%,10.7%與3.2%。

2.1.4 精密度實驗 低、中、高濃度的血漿樣品日內RSD(n=5)分別為4.7%,4.2%,3.8%；日間RSD(n= 5)分別為6.6%,1.4%,6.2%。

2.1.5 凍融穩定性實驗 低、中、高濃度的血漿樣品RSD分別為1.2%,1.8%,6.1%,比較4次凍融的峰面積與凍融前峰面積,RSD＜10%,符合生物樣品分析要求。表明樣品在4次凍融過程中穩定。

2.2 血藥濃度-時間曲線 6只比格犬單劑量給藥,利魯唑片和利魯唑膠囊的平均血藥濃度-時間曲線見圖2A和圖2B,曲線滿足一室模型,權重系數為1/C2。

A.空白血漿;B.對照品;C.樣品;1.利魯唑;2.內標圖1 3種血漿的HPLC圖A.blank plasma；B.reference substance；C.sample；1 riluzole；2.internal standardFig.1 HPLC chromatogram of three kinds of plasma samples

A.利魯唑片;B.利魯唑膠囊圖2 兩種樣品的平均血藥濃度-時間曲線A.riluzole tablets；B.riluzole capsulesFig.2 Mean plasma concentration-time curve of two kinds of samples

2.3 數據處理 采用DAS2.0版軟件對數據進行藥動學模型擬合,利魯唑片和利魯唑膠囊血的藥濃度數據符合一室開放模型,房室模型參數見表1。利魯唑膠囊對利魯唑片的相對生物利用度(105.9±30.6)%。

目前大多采用AUC和Cmax經對數轉換后以多因素方差分析進行顯著性檢驗,然后用雙單側t檢驗和計算90%置信區間的統計分析方法來評價和判斷藥物間的生物等效性。經對數轉換后的受試制劑的AUC在參比制劑的80%～125%范圍內,受試制劑的Cmax在參比制劑的75%～133%范圍內,對于tmax,經非參數法檢驗差異無統計學意義,可判斷兩藥生物等效[5]。

單次灌服相當于5 mg·kg-1利魯唑的利魯唑片和市售利魯唑膠囊后,AUC0-∞的幾何均值分別為1 282.57和1 297.22 ng·mL-1·h,比率為0.99,90%可信限為(0.82,1.15),在0.80～1.25等效范圍內；Cmax的幾何均值分別為56.24和60.82 ng·mL-1,比率為0.92,90%可信限為(0.78,1.09),在0.75～1.33等效范圍內；tmax的幾何均值是6.00和6.23 h,比率為0.96,90%可信限為(0.82,1.14)在0.80～1.25等效范圍內[6-7]。

結果表明,利魯唑片和利魯唑膠囊在比格犬內初步具有生物等效性,還需做這兩種制劑在大量動物或人體內的實驗等進一步來驗證其生物等效性。

2.4 體內外相關性研究 按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部中要求進行體內外相關性的試驗,“只有當體內外具有相關性,才能通過體外釋放曲線預測體內情況”。因此,為評價自制利魯唑片的體外釋放條件的合理性,筆者研究了利魯唑片體外釋放與體內吸收的相關性。

由犬體內釋放研究結果可知,比格犬單劑量服用利魯唑片后,利魯唑在體內的吸收符合一室模型,因此選用Wanger-Nelson法計算利魯唑片在比格犬體內不同時間點的吸收分數[8-9],公式為:

其中Ct為t時間的血藥濃度；Ke為消除速度常數, AUC用梯形面積法計算。計算結果見表2。

由利魯唑片在比格犬體內的血藥濃度-時間曲線及以上的體內吸收分數表明,利魯唑片6～7 h達到峰濃度,以8 h前的血藥濃度-時間作為吸收相,以利魯唑片體外累積釋放度結果進行考察,結果見表3。

表1 比格犬單劑量給予利魯唑片和利魯唑膠囊經時血藥濃度數據模型擬合參數Tab.1 Fitting parameters of plasma concentration-time data after a single dose of riluzole tablets or riluzole capsules in Beagle dogs ±s

表1 比格犬單劑量給予利魯唑片和利魯唑膠囊經時血藥濃度數據模型擬合參數Tab.1 Fitting parameters of plasma concentration-time data after a single dose of riluzole tablets or riluzole capsules in Beagle dogs ±s

制劑t1/2/ h AUC0-72AUC0-∞(ng·mL-1·h) MRT0-72tmaxhCmax/ (ng·mL-1)利魯唑膠囊12.57±3.251 283.50±313.81 1 297.22±297.3921.47±6.136.23±2.7260.82±18.13利魯唑片12.43±3.871 255.83±311.39 1 282.57±322.6420.42±5.056.00±2.6056.24±16.51

表2 利魯唑片在比格犬體內不同時間點的吸收分數Tab.2 Absorption rate of riluzole tablets in Beagle dogs at different time points

表3 利魯唑片體內吸收分數與對應時間點的體外釋放度Tab.3 In vivo absorption rate and in vitro release rate at the corresponding time points %

以體內吸收分數Y對體外釋放度X進行線性回歸,方程為:Y=0.777X+8.260,r=0.963。

根據《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄要求,查得臨界相關系數為0.951(P＜0.01,自由度f為5)。本品相關系數(0.963)大于臨界相關系數(P＜0.01),表明利魯唑片體內外相關良好。

3 討論

筆者尚未見國內文獻報道血中利魯唑濃度的測定方法,國外報道過采用紫外檢測的HPLC法和液相色譜-質譜聯用技術的檢測法[10]。筆者在本實驗建立了靈敏、重復性好、準確度高的血中利魯唑濃度的HPLC法,測定了6只健康比格犬單劑量服用利魯唑參比制劑與受試制劑50 mg后利魯唑血漿濃度。tmax、Cmax、AUC0-72、AUC0-∞經多因素方差分析,這兩種制劑給藥周期間和藥物間均差異無統計學意義(P＞0.05),兩者具有生物等效性。

利魯唑片在犬體內吸收程度與參比制劑相當,體內外相關性良好,表明利魯唑片和膠囊劑都是理想的制劑類型。

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.008

Study on Pharmacokinetics and in Vitro-in Vivo Correlation of Riluzole Tablets in Dogs

MU Jin-chao,LIU Chun-fen
(Xuzhou College of Industrial Technolegy,Xuzhou 221140,China)

Objective To study the pharmacokinetic parameters of riluzole tablets and commercial riluzole capsules in Beagle dogs,and evaluate the correlation between the release ratein vitroand the absorptionin vivo,and calculate the relative bioavailability of riluzole tablets.MethodsSix Beagle dogs were treated with 50 mg of riluzole tablets or capsules,and then cross-treated by the other drug after 14-days wash out period.Blood concentration of riluzole was measured by high performance liquid chromatography(HPLC).The atrioventricular model was used to calculate the pharmacokinetic parameters and Wanger-Nelson method was applied to assess the correlation between the release ratein vitroand the absorptionin vivo.ResultsThet1/2,tmax,Cmax,AUC0-72and AUC0-∞in the tablet and capsule groups were(12.43±3.87)and(12.57±3.25)h,(6.00±2.60)and (6.23±2.72)h,(56.24±16.51)and(60.82±18.13)ng·mL-1,(1 255.83±311.39)and(1 283.50±313.81)ng·mL-1·h, (1 282.57±322.64)and(1 297.22±297.39)ng·mL-1·h,respectively.The relative bioavailability of capsules versus tablets was (105.9±30.6)%.ConclusionHPLC method can be applied to measure the concentration of blood riluzole with little interference and high levels of repeatability and accuracy.The absorption in Beagle dogs between riluzole tablets and capsules was equal,and a good correlation between thein vivoabsorption andin vitrorelease has been found in this study.

Riluzole;Pharmacokinetics;Chromatography,high performance liquid

R971；R965

A

1004-0781(2014)09-1149-05

2013-08-07

2013-11-22

慕金超(1978-),男,安徽蒙城人,講師,高級技師,碩士,研究方向:藥學和食品營養。電話:(0)13813465389, E-mail:mujc@mail.xzcit.cn。

劉春芬(1978-),女,天津人,講師,碩士,研究方向:食品微生物與發酵工程。電話:(0)15205201886,E-mail:liucf@mail.xzcit.cn。