分子排阻色譜法測定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物

阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004)

分子排阻色譜法測定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物

阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004)

目的 建立測定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的方法。方法采用Sephadex G-10凝膠色譜柱,以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動相A,以水為流動相B,流速1.5 mL·min-1,檢測波長254 nm。結果磺芐西林高分子聚合物與磺芐西林能較好分離,磺芐西林對照品在進樣量為含磺芐西林0.59～47.46 μg范圍內,線性關系良好(r=0.999 9);供試品溶液在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內,溶液濃度與聚合物峰面積呈良好線性關系(r=0.999 4);重復性較好(RSD=4.3%,n=5);重現性較好(RSD=4.8%,n=3)。結論該方法簡便,結果可靠,可以用于注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的檢測。

磺芐西林鈉；高分子聚合物；分子排阻色潽

磺芐西林屬廣譜半合成青霉素類抗生素,主要適用于對本品敏感的銅綠假單胞菌、變形桿菌屬以及其他敏感革蘭陰性菌所致的肺炎、尿路感染、復雜性皮膚軟組織感染和敗血癥等[1]。

磺芐西林鈉致變態反應常見。多年來的研究已證明,在β-內酰胺類抗生素所致的速發型變態反應中,藥物分子本身只是半抗原,藥物中存在的高分子聚合物才引發速發型變態反應[2],因此嚴格控制抗生素中高分子聚合物的含量有著重要的意義?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版采用Sephadex G-10凝膠色譜柱柱床體積變小,減少了分析時間(45～60 min)[3]。在水中,磺芐西林鈉由于分子間的氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等可以形成締合物[4],與高分子聚合物具有相似的色譜行為,因此可以采用藥物自身為對照品,按外標法計算。筆者在文獻[5-6]的基礎上,優化并建立了測定注射用磺芐西林鈉中的聚合物的方法,縮短了分析時間,為更好地控制產品質量提供了參考。

1 儀器與試藥

上海金達生化儀器有限公司KFG-1抗生素高聚物分析系統(紫外檢測器),色譜柱為葡聚糖凝膠G-10 (40～120 μm)填充柱(內徑1.0 cm,柱高40 cm)?；瞧S西林鈉對照品(浙江省食品藥品檢驗研究院,批號: 20040601,含量:82.4%);注射用磺芐西林鈉(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501;瑞陽制藥有限公司,批號:08122212);葡聚糖凝膠Sephadex G-10為進口分裝(Amersham Biosciences);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、藍色葡聚糖2 000(GE Pharmacia)均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 用葡聚糖凝膠G-10(40～120 μm)為填充劑,玻璃柱(1.0 cm×40 cm),以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動相A,以水為流動相B,流速1.5 mL·min-1,檢測波長為254 nm。量取0.2 mg·mL-1藍色葡聚糖2 000溶液100 μL,注入液相色譜儀,分別以流動相A、B進行測定,理論板數按藍色葡聚糖2000峰計算,在流動相A與B中理論板數及拖尾因子均符合要求,理論板數為872,919,均大于700,拖尾因子為1.44,1.16,均＜2.0。

2.2 分離度實驗 根據《中華人民共和國藥典》2010年版[3]附錄ⅤH分子排阻色譜法規定,檢查高分子聚合物時,某些藥物分子單體與其聚合體不能達到基線分離時,其分離度計算公式為:R=高聚體的峰高/單體與高聚體之間的谷高。

分離度實驗溶液:由于高分子聚合物的對照品不易獲得,而樣品中的高聚物又極少,在配制分離度溶液時,適當加入藍色葡聚糖2 000,使聚合物峰增大。藍色葡聚糖2 000系在葡萄糖T2 000(平均相對分子質量2 000 000)上引入多環生色團冷凍干燥而成。在凝膠過濾法中,用于各種類型葡萄糖的床空隙容積的測定和校核柱的填充。一般藍色葡聚糖2 000的加入量是使聚合物峰面積達到規定限度的1～2倍。

稱取磺芐西林鈉約300 mg,置10 mL量瓶,用0.2 mg·mL-1藍色葡聚糖溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,進樣100 μL,用流動相A進行測定,記錄色譜圖進行分析,得高聚物峰的含量為0.80%(擬規定限度為0.5%),分離度為2(圖1)。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液 取磺芐西林鈉對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量制成每毫升含磺芐西林60 μg的溶液,以流動相B進樣測定。

2.3.2 供試品溶液 取本品約0.3 g,精密稱定,置10 mL量瓶,加水適量,使溶解后,用水稀釋至刻度,搖勻,以流動相A立即進樣測定(圖2)。

圖1 分離度實驗色譜圖

圖2 供試品的聚合物圖譜(流動相A)1.高分子聚合物;2.磺芐西林鈉

2.4 專屬性實驗 已知用藍色葡聚糖2000溶液實驗測得的流出時間(圖3),即為Kav=0。在上述規定的色譜條件下,在Kav=0時,樣品中有一峰流出(tR為8.6 min),至12 min后藥物單體開始流出(圖4),且分離度符合要求。故確認為tR為8.6 min時的峰即為聚合物峰。

2.5 對照溶液線性關系考察 精密稱取磺芐西林鈉對照品14.40 mg,置25 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。用水逐步精密稀釋,制成分別含磺芐西林5.93, 29.67,59.33,118.66,237.31和474.62 μg·mL-1的溶液,分別按“2.1”項色譜條件以流動相B進行測定。以對照品濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸,回歸方程Y=406.84X+1 679.1,r= 0.9999,表明對照品溶液濃度在5.9～474.6 μg·mL-1范圍內(進樣100 μL),溶液濃度與測得的峰面積呈良好的線性關系。

圖3 流動相B中藍色葡聚糖2 000(A)與對照溶液(B)的色譜圖比較

2.6 定量限與檢測限 取“2.5”項5.93 μg·mL-1溶液,精密稀釋10倍,按“2.1”項色譜條件以流動相B進行測定,記錄色譜圖,并對色譜系統進行基線檢測,結果最低檢測濃度為1.02 μg·mL-1(S/N=3),計算最低檢測限為0.003%,最低檢測量0.102 μg,最低定量限0.01%(S/N=10)。

2.7 精密度實驗 精密稱取磺芐西林鈉對照品18.96 mg,置于250 mL量瓶,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取100 μL注入液相色譜儀,按“2.1”項色譜條件,以流動相B為流動相進行測定。連續進樣5次,記錄色譜圖,以峰面積計算,RSD為4.1%,小于5.0%,說明精密度良好[3]。

2.8 重復性實驗 精密稱取注射用磺芐西林鈉樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501)約0.3 g,稱取5份,分別置10 mL量瓶,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另取精密度實驗溶液,作為對照品溶液。按“2.1”項色譜條件測定,分別精密量取100 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。含磺芐西林聚合物以磺芐西林計,結果分別為0.12%,0.11%, 0.10%,0.11%,0.11%,RSD=4.3%,表明本方法重復性良好。

2.9 重復性實驗 取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501),在不同日期按“2.8”項方法共測定3次,結果分別為0.11%,0.12%,0.11%,RSD=4.8%,表明本方法重復性良好。

2.10 樣品取樣量對聚合物測定結果的相關性考察 分別取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501) 200,300,400 mg,置3個10 mL量瓶,按“2.1”項色譜條件以流動相A進行測定。以供試品濃度(C, mg·mL-1)為橫坐標,高分子聚合物峰面積為縱坐標,進行線性回歸,回歸方程Y=371.87X+4 820.5,r= 0.999 4,表明供試品溶液濃度在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內(進樣100 μL),供試品溶液濃度與測得的高分子聚合物峰面積呈良好的線性關系。

2.11 樣品的聚合物測定 按“2.3.1”和“2.3.2”項方法及“2.1”項色譜條件,測定2批樣品磺芐西林聚合物(表1)。

表1 樣品中高分子聚合物測定結果 %

3 討論

3.1 流動相的選擇 流動相A:流動相的種類和濃度可以改變溶質的色譜行為和分離效果[7],故選用pH 7.0的0.1,0.05,0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液分別作為流動相A,流速均為1.5 mL·min-1。在pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A時分離最好,故選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A。

流動相B:選用水作為流動相B,用每毫升約含60 μg的磺芐西林鈉溶液,進樣100 μL進行測定。結果表明磺芐西林鈉在以水作為流動相的條件下能完全締合形成表觀分子量較大的締合物,在Sephadex G-10凝膠色譜系統中的色譜行為與聚合物相似,都在Kvo= 0處流出,表現為單一色譜峰,故采用自身對照外標法。

3.2 流速的選擇 選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A時,比較流速為1.0和1.5 mL·min-1的分離情況,可見二者分離都較好。因流速為1.5 mL·min-1時分離好且較快出峰,故選用該流速。

筆者在本實驗中選用比文獻[6-7]鹽濃度更高的緩沖液及更快的流速,使得整個樣品的分析時間縮短一半以上,且分離效果更好。故本實驗建立的注射用磺芐西林鈉高分子聚合物檢測方法簡便快速、結果準確、重現性好,對于保證藥品質量和用藥安全均具有重要的意義。

[1] 國家藥典委員會.臨床用藥須知[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

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[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄37,1138-1139.

[4] HU C Q,JIN S H,WANG K M.The chromatographic behaviour of cephalosporins in gel filtration chromatography,a novel method to separate high molecular with impurities[J]. Pharm Biomed Anal,1994,12(4):533-541.

[5] 田貴容,呂露陽,方梅.Sephadex G10凝膠色譜法測定磺芐西林鈉中的高分子雜質[J].華西藥學雜志,2007,22 (6):699-700.

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.033

R978.1;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0386-03

2013-02-18

2013-03-20

阮昊(1981-),女,浙江杭州人,主管藥師,碩士,主要從事抗生素藥品質量研究。電話:0571-86459427,E-mail：clare_ruan@163.com。

陳悅(1971-),男,浙江永康人,主任藥師,學士,主要從事抗生素藥品質量研究。電話:0571-86459427,E-mail：13868057010@163.com。