正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝

易生富，陳兵，孫亞楠

(1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，荊州 434020;2.湖北省荊州市中醫(yī)院藥劑科，荊州 434010)

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝

易生富1，陳兵2，孫亞楠1

(1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，荊州 434020;2.湖北省荊州市中醫(yī)院藥劑科，荊州 434010)

目的 優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝。方法以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),采用3因素3水平正交設(shè)計(jì),以黃芪甲苷、總多糖及80%醇浸出物量作為指標(biāo)值。結(jié)果煎煮次數(shù)和加水量對(duì)黃芪甲苷、總多糖及80%醇浸出物量具顯著影響,優(yōu)選煎煮提取工藝為煎煮3次,加12倍量水,煎煮0.5 h。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)確定了血脈疏通口服液的最佳提取工藝。

血脈疏通口服液；正交實(shí)驗(yàn)；水提工藝；黃芪甲苷

血脈疏通口服液為湖北省荊州市中醫(yī)院自制中藥制劑(自制制劑批準(zhǔn)文號(hào):鄂藥制字Z20110885),由赤芍、黃芪、牛膝、防風(fēng)、桃仁、地龍、葛根、石菖蒲等組成,具益氣、活血、通脈的作用,用于治療因氣虛血瘀所致的冠心病、心絞痛及脂肪肝有很好療效,治療冠心病、心絞痛患者70例,總有效率93.33%;治療脂肪肝患者176例,總有效率89.16%[1-2]。方中牛膝、黃芪、赤芍、葛根、桃仁等藥含皂苷類、黃酮類和多糖類,考慮水煎煮法提取;石菖蒲、防風(fēng)含揮發(fā)油,在提取揮發(fā)油后,再與赤芍、黃芪、牛膝、葛根、桃仁等藥合煎。為了保證制劑質(zhì)量,筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,優(yōu)化血脈疏通口服液煎煮提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waterse-2695高效液相色譜儀,Empower工作站,Waters-2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國沃特士公司);Ohaus-AR124CN型電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司);UV-3000型可見紫外分光光度計(jì)(日本島津);高速離心機(jī)(美國MICRO12-24)。

1.2 試藥 黃芪甲苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110683-200916),血脈疏通口服液(自制,批號(hào):20120119,規(guī)格:每支10 mL),乙腈為色譜純,葡萄糖對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110976-200903),其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備 按處方比例,稱取石菖蒲6 g、防風(fēng)8 g,按提油工藝提油,濾過得藥液和藥渣備用。按處方比例,稱取黃芪30 g、赤芍10 g、牛膝10 g、桃仁8 g、葛根10 g、地龍8 g與石菖蒲、防風(fēng)提油后的藥渣混合,按規(guī)定的加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)提取、過濾、濃縮并定容至100 mL(每毫升含生藥0.9 g)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)樣品的制備方法,分別調(diào)整加水量8,10,12,14倍,煎煮時(shí)間0.5,1.0,1.5, 2.0 h,煎煮次數(shù)1,2,3,4次,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 加水量的影響 在煎煮時(shí)間為1 h,煎煮1次,加水量從8倍增加到12倍時(shí),總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加較多。但當(dāng)加水量增至14倍后,總多糖含量、黃芪甲苷含量近乎沒有變化,80%醇浸出物量增加緩慢。因此,加水量應(yīng)選定為約12倍宜。

2.2.2 煎煮次數(shù)的影響 在加水量為12倍,煎煮時(shí)間1 h,隨著煎煮次數(shù)的增加,總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量相應(yīng)增加。當(dāng)煎煮次數(shù)增加到4次以后,總多糖含量、黃芪甲苷含量增加緩慢,80%醇浸出物量有增加但雜質(zhì)增加較多。因此煎煮次數(shù)選為3次宜。

2.2.3 煎煮時(shí)間的影響 在加水量為12倍,煎煮3次的條件下,隨著煎煮時(shí)間的延長,總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加緩慢,考慮到節(jié)約工時(shí),煎煮時(shí)間選為0.5 h。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取煎煮時(shí)間、加水量、煎煮次數(shù)3個(gè)因素,各取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。黃芪是方中君藥,黃芪甲苷是其主要有效成分,以黃芪甲苷含量評(píng)價(jià)指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.5;黃芪中多糖為有效成分,方中牛膝、葛根、防風(fēng)也含有多糖,因此總多糖含量作為另一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.3;80%醇浸出物為大類成分作為間接控制的指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.2,以此篩選最佳提取工藝[3]。綜合評(píng)分=0.5×黃芪甲苷含量+0.3×總多糖含量+0.2×80%醇浸出物量。正交實(shí)驗(yàn)表見表1,2。

2.4 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.4.1 分析方法的選擇 黃芪甲苷含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有高效毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、半高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法等[4-7]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD檢測(cè)法[8]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.4.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(35∶65);檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器200 s;柱溫35℃;漂移管溫度65℃;氣體流量:1 L·min-1;進(jìn)樣量:10 μL;理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品2 mg于10 mL量瓶,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即可得到0.2 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.4.4 供試品溶液的制備 精密吸取各正交實(shí)驗(yàn)樣品溶液10 mL,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次20 mL,棄去氨液,正丁醇液水浴蒸干,殘?jiān)铀? mL使溶解,通過D101型大孔吸附樹脂(內(nèi)徑1.5 cm,長12 cm),用水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去40%乙醇洗脫液,繼用70%乙醇50 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶,加甲醇至刻度,搖勻即得[9-10]。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液1,2, 4,6和8 mL分別置于10 mL量瓶,分別加甲醇稀釋定容,搖勻,即得0.02,0.04,0.08,0.12和0.16 mg·mL-1對(duì)照液。取以上溶液各20 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜峰。以峰面積(Y)與濃度(X,μg·mL-1)進(jìn)行回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=58 102X+1 052.7,r=0.999 3(n=5)。結(jié)果表明,樣品在0.4～3.2 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6 陰性干擾的判斷 照供試品溶液的制備方法制備缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液,依照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,供試品溶液色譜圖中,在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液無相應(yīng)的色譜峰。

2.4.7 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)已配制的1.6 μg·mL-1黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,分別測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD為0.58%(n=5)。

2.4.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,分別在0,2,4, 6,8,10,12 h測(cè)定進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,計(jì)算RSD,結(jié)果RSD為0.47%(n=7),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1.6 μg·mL-1黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液5份,在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積,RSD為0.53%(n=5),重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 量取供試品溶液20 μL5份,各加入不同量的對(duì)照品溶液,按“2.4.5”項(xiàng)方法測(cè)定峰面積,計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。平均加樣回收率98.8%,RSD=1.02%。

2.4.11 樣品含量測(cè)定 精密量取各供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀,在色譜條件下記錄色譜峰,將峰面積代入回歸方程中,得到溶液中黃芪甲苷的濃度,進(jìn)一步計(jì)算得到黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表2。

2.5 總多糖含量測(cè)定 總多糖含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)等[11-13]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用苯酚-硫酸法。

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品60 mg置于100 mL量瓶,加純化水溶解至刻度,即得0.6 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.5.2 苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚4.0 g于100 mL量瓶,加水溶解至刻度,即得4%苯酚溶液,移至棕色瓶中保存。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.0, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0 mL分別轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。精密量取上述各溶液2.0 mL置10 mL具塞試管,分別精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0 mL,搖勻,沸水保溫15 min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫,以第一份為空白對(duì)照液,在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描,得最大吸收波長為487 nm。在487 nm波長處,測(cè)定各對(duì)照品吸光度,以濃度(Y)為橫坐標(biāo)、吸光度(X)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=0.022 6X+0.008 9,r= 0.999 6(n=5)。

2.5.4 樣品溶液的配制 精密吸取各樣品濃縮液,加無水乙醇4 mL,邊加邊振搖,使含醇量達(dá)80%, 2 000 r·min-1離心20 min,沉淀以水溶解,轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。

2.5.5 精密度實(shí)驗(yàn) 按“2.5.3”項(xiàng)方法重復(fù)測(cè)定同一濃度葡萄糖對(duì)照品溶液5次,計(jì)算測(cè)定結(jié)果RSD為0.61%。

2.5.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品溶液,按“2.5.3”項(xiàng)方法在室溫每隔30 min測(cè)定一次,連續(xù)3 h考察其穩(wěn)定性,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD為1.21%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.5.7 樣品含量測(cè)定 精密吸取項(xiàng)樣品溶液2.0 mL,置10 mL具塞試管,分別精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0 mL,搖勻,沸水保溫15 min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫。以純化水為空白,同法制得空白對(duì)照品液。在487 nm波長處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多糖含量。結(jié)果見表2。

2.6 80%醇浸出物量測(cè)定 取各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)濃縮液10 mL,加無水乙醇40 mL,使乙醇濃度達(dá)到80%,靜置過夜,取上清液于干燥蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105℃烘箱干燥3～4 h至恒重,取出,迅速移至干燥器中放冷,取出精密稱重即得。結(jié)果見表2。

表3 黃芪甲苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mg,n=5

2.7 方差分析 對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果作直觀分析和方差分析。方差分析見表4。

表4 方差分析表

由直觀分析可知,影響提取效果的因素順序?yàn)?煎煮次數(shù)＞加水量＞煎煮時(shí)間。經(jīng)方差分析,煎煮時(shí)間對(duì)提取效果無顯著影響,為節(jié)約工時(shí),定為B1,煎煮次數(shù)和加水量有顯著影響,以A3C3為宜。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證3批。結(jié)果見表5。RSD值＜3%,表明所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定。

3 討論

方中黃芪為君藥,黃芪甲苷和多糖為黃芪的主要有效成分[14],現(xiàn)代藥理研究表明黃芪甲苷具有保護(hù)心臟和肝臟、抗細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、改善血液流變學(xué)等作用[15],黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、保肝、降血糖、降血脂、抗氧化延緩衰老等藥理活性[16],故將黃芪甲苷含量作為評(píng)價(jià)工藝優(yōu)劣的重要指標(biāo)。方中臣藥牛膝,佐藥葛根、防風(fēng)也含有多糖,因此將總多糖含量作為提取工藝的另一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),80%醇浸出物為大類成分,作為間接控制指標(biāo),以此篩選最佳提取工藝具有一定的科學(xué)性。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %,n=3

按正交實(shí)驗(yàn)所篩選的最佳提取條件,本實(shí)驗(yàn)還比較了石菖蒲、防風(fēng)二藥提油后藥渣不再與黃芪、赤芍等藥合煎水提和二藥提油后藥渣與黃芪、赤芍等藥合煎水提兩種方法主要有效成分的影響。結(jié)果表明,分煎后出膏率降低近10%,黃芪甲苷含量無影響,總多糖含量近無影響,為降低出膏率,給后續(xù)除雜工藝降低難度,可以考慮將提取路線定為:石菖蒲、防風(fēng)二藥提油后藥渣棄去,藥液與黃芪、赤芍等藥水提液合并。

[1] 黨安琪.血脈舒通口服液治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征60例[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2001,8(7):54.

[2] 黨安琪,林慶,嚴(yán)光俊,等.血脈舒通口服液治療非酒精性高脂血癥性脂肪肝166例臨床觀察[J].中國中醫(yī)藥科技,2005,12(3):180-181.

[3] 解斌,高華宏,劉滿華,等.加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯濃縮丸提取工藝研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(3):272-273.

[4] 陳巧霞,韓樂,劉訓(xùn)紅,等.HPCE同時(shí)測(cè)定黃芪飲片中3種指標(biāo)成分的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28 (3):275-278.

[5] 李生有.雙波長薄層掃描法測(cè)定益心康泰膠囊中黃芪甲苷含量[J].中成藥,2006,28(12):1855-1856.

[6] 郭兆榮,李笑然,楊世林,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定雪膽胃腸丸中黃芪甲苷的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(1):88-90.

[7] 鄭重,宋鳳瑞,劉舒,等.Semi-LC/MS技術(shù)快速定量分析黃芪樣品中黃芪甲苷含量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2012,4(1): 36-38.

[8] 單玉,董曉茜,張振秋,等.HPLC-ELSD測(cè)定黃芪苦參藥對(duì)提取物中黃芪甲苷的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,12(1):187-188.

[9] 南換杰,李曉娜,秦雪梅,等.黃芪及其制劑中測(cè)定黃芪甲苷含量時(shí)供試液制備方法的改進(jìn)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(19):1627-1630.

[10] 馬明英,張曉峰,付超美,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定那保膠囊中黃芪甲苷含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(11):1530-1531.

[11] 魏曉明,符紅,萬幼平,等.硫酸-蒽酮法測(cè)定鹿龜酒中多糖含量[J].中成藥,2000,22(5):380-382.

[12] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:78.

[13] 陳發(fā)奎.常用中藥有效成分含量測(cè)定[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:620-622.

[14] 溫燕梅.黃芪的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中成藥,2006,28 (6):879-883.

[15] 牛嵩山.黃芪甲苷的藥理研究進(jìn)展[J].國醫(yī)論壇,2012, 27(4):53-54.

[16] 何文涓,衰志堅(jiān),何曉升.黃芪多糖的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2012,33(5):692-694.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.032

R286;TQ460.1

A

1004-0781(2014)03-0382-04

2013-07-05

2013-08-22

易生富(1966-),男,湖北荊州人,主任藥師,學(xué)士,主要研究方向:中藥制劑。電話:0716-8023540,E-mail：yishenfu@126.com。