硫辛酸膠囊含量測定及其穩定性

馬宏達，胡北，吳瓊，崔英宇，史國兵

(沈陽軍區總醫院藥劑科，沈陽 110016)

硫辛酸膠囊含量測定及其穩定性

馬宏達，胡北，吳瓊，崔英宇，史國兵

(沈陽軍區總醫院藥劑科，沈陽 110016)

目的 建立測定硫辛酸膠囊中硫辛酸含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,并考察其穩定性。方法采用RP-HPLC法測定硫辛酸的含量。采用Diamonsil C18色譜柱,流動相為乙腈-0.15%磷酸(38∶62),檢測波長為220 nm。采用影響因素實驗、加速實驗和長期實驗考察硫辛酸膠囊穩定性。結果硫辛酸濃度在5～500 μg·mL-1范圍內線性關系良好;平均回收率99.23%,精密度、穩定性等均符合測定要求。硫辛酸對光照較敏感,在市售包裝下,穩定性較好。結論RP-HPLC法操作簡單,結果準確,重復性好,可用于硫辛酸的含量測定。硫辛酸在避光、室溫條件下,能較長時間保存。

硫辛酸；含量測定；穩定性；色譜法,高效液相,反相

硫辛酸(alpha lipoic acid)的化學名為(±)[3-(1, 2-二硫雜環戊烷)]-戊酸(1,2-dithiolane-3-pentanoic acid.),其氧化性和還原性可以互相轉化[1]。硫辛酸具備一般抗氧化劑所不能及的抗氧化性[2],它作為線粒體中丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶,在細胞能量代謝中發揮重要作用[3-4]。硫辛酸能有效控制血糖,消除氧自由基,螯合金屬離子,再生其他抗氧化藥,是強效多功能氧化應激抑制藥,在改善人的體質,抗氧化,以及糖代謝、糖尿病并發癥和其他多種疾病治療方面備受關注[5]。文獻報道采用電化學檢測法[6]、脈沖安培檢測法[7]或熒光檢測法[8]等方法進行測定。筆者在本研究中采用反相高效液相色譜法,建立了硫辛酸膠囊的含量測定方法,該方法操作簡單,結果準確,重復性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(包括600泵, 2487檢測器),KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),AUW120D型分析天平(島津公司)。穩定性實驗箱(重慶市永生實驗儀器廠)。

1.2 試藥 硫辛酸對照品(Sigma公司,批號:100588-200501),乙腈(色譜純,Fisher公司),水為雙蒸水,其他試劑為化學純。硫辛酸膠囊為沈陽軍區總醫院制劑研發室提供(批號:20110901,20110902,20110903)。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 溶液的配制 對照品溶液的制備:取硫辛酸對照品5 mg精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,得到50 μg·mL-1對照品溶液。

供試品溶液的制備:取硫辛酸膠囊20粒,倒出內容物混合均勻。取內容物適量(約相當于硫辛酸5 mg)精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,取續濾液得到硫辛酸供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(5 μm,200× 4.6 mm,Dikma公司);流動相:乙腈∶0.15%磷酸= 38∶62;流速:1 mL·min-1;進樣量:20 μL;柱溫:25℃。

2.1.3 檢測波長的選擇 取硫辛酸對照品適量,溶于適量乙腈∶水(1∶1)溶液,稀釋至適宜濃度后,在波長200～400 nm范圍內掃描測定。根據掃描結果可知,硫辛酸無顯著最大吸收波長,因此選用220 nm作為檢測波長。

2.1.4 專屬性實驗 分別取硫辛酸對照品溶液、供試品溶液、不含硫辛酸的陰性溶液各20 μL,注入HPLC系統,色譜圖見圖1。由色譜圖可知,硫辛酸在此色譜條件下峰形良好,保留時間約12.3 min,與其他色譜峰分離良好,表明處方中其他輔料成分對硫辛酸的測定無干擾,該色譜方法專屬性較強。

圖1 3種溶液高效液相色譜圖A.空白輔料;B.對照品溶液;C.樣品溶液;1.硫辛酸Fig.1 HPLC chromatogram of lipoic acidA.negative sample;B.reference substance;C.sample;1. 1ipoic acid

2.1.5 線性關系考察 取硫辛酸對照品適量精密稱定,置于棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液,超聲5 min溶解,定容,配制硫辛酸對照品溶液,使其濃度為5,10,20,50,100,200和500 μg·mL-1。按上述色譜條件注入HPLC系統,記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標,硫辛酸濃度(C)為橫坐標,進行線性回歸,得到標準曲線方程為A=7 176.686C-5 053.425,r= 0.999 9。由此可知,硫辛酸在5～500 μg·mL-1范圍內,其濃度與峰面積線性關系良好。

2.1.6 檢測限 取硫辛酸對照品溶液作為母液,采用乙腈∶水(1∶1)溶液逐級倍比稀釋,將稀釋后的溶液注入高效液相色譜系統,記錄色譜圖,當信噪比為3時,計算該色譜條件下的檢測限。經計算,檢測限為16.6 ng。

2.1.7 精密度實驗 取50 μg·mL-1硫辛酸對照品溶液,連續進樣6次,記錄峰面積,計算日內精密度,連續進樣3 d,計算日間精密度。實驗結果顯示,硫辛酸日內精密度0.59%,日間精密度0.74%,說明該方法精密度良好。

2.1.8 穩定性實驗 取同一供試品溶液,每隔2 h進樣一次,分別于0,2,4,6,8,10,12 h進樣,記錄硫辛酸色譜峰面積。實驗結果顯示,穩定性RSD為0.59%,表明硫辛酸供試品溶液12 h內穩定性良好。

2.1.9 重復性實驗 取同一批硫辛酸膠囊,制備供試品溶液,共6份,按上述色譜方法測定,外標法計算硫辛酸含量。實驗結果顯示,硫辛酸在樣品平均含量為標示量的99.92%,重現性RSD為0.79%,表明該色譜方法重復性良好。

2.1.10 回收率實驗 取已知含量的硫辛酸膠囊50粒,倒出內容物混合均勻。取內容物適量精密稱定,共9份,再分別加入硫辛酸樣品的80%、100%、120%的硫辛酸對照品,每樣各3份,按“2.1.1”項方法制備成供試溶液。分別取20 μL,外標法測定硫辛酸含量,計算樣品回收率,結果見表1。實驗結果顯示,方法平均回收率99.23%,RSD為1.64%,此方法回收率良好。

表1 加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery test mg,n=9

2.1.11 樣品測定 取硫辛酸膠囊20粒,倒出內容物混合均勻。取內容物適量(相當于硫辛酸5 mg)精密稱定,置于100 mL棕色量瓶,加入適量乙腈∶水(1∶1)溶液超聲溶解,取出后放至室溫,定容,濾過,取續濾液得到硫辛酸供試品溶液。取供試品溶液20 μL,注入高效液相色譜系統,記錄峰面積,外標法計算硫辛酸含量。共測定了3批硫辛酸膠囊,硫辛酸含量分別為標示量的99.92%,99.17%和100.84%,均符合質量標準要求。

2.2 穩定性考察

2.2.1 影響因素實驗 高溫實驗:取適量硫辛酸膠囊,置于培養皿,置于穩定性實驗箱,在40℃下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內容物性狀變化,并測定硫辛酸含量變化。

高濕實驗:取適量硫辛酸膠囊,置于培養皿,置于穩定性實驗箱,分別在相對濕度92.5%環境中下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內容物性狀變化及吸濕增重,并測定硫辛酸含量變化。

強光實驗:取適量硫辛酸膠囊放置于培養皿,置于穩定性實驗箱,在相當于照度(4 000±500)Lx環境中下放置10 d,分別于放置后5,10 d取樣,觀察內容物性狀變化,并測定硫辛酸含量變化。結果見表2。

表2 影響因素實驗結果Tab.2 Results of test on influential factor

實驗結果表明,高溫(40℃)、高濕對硫辛酸的穩定性基本沒有影響,強光照射對硫辛酸的性狀及含量有較大影響。提示硫辛酸制劑應放置在陰涼處,避光保存。

2.2.2 加速實驗 取市售包裝硫辛酸膠囊3批,置于(40±2)℃、相對濕度(75±5)%恒溫恒濕箱中,分別在0,1,2,3,6個月,取樣測定有關質量指標。實驗結果表明,本品經加速實驗考察6個月,各項指標與實驗前比較,內容物性狀和硫辛酸含量均無變化,符合質量標準規定。

2.2.3 長期實驗 取市售包裝硫辛酸膠囊3批,置于(25±2)℃、相對濕度(60±10)%恒溫恒濕箱中,分別在0,3,6個月,取樣測定有關質量指標。實驗結果表明,本品經室溫留樣觀察法考察6個月,各項指標與實驗前比較,內容物性狀和硫辛酸含量均無變化,符合質量標準規定。

3 討論

筆者本實驗還考察了流動相種類,有機相分別考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈,水相分別考察了磷酸、磷酸二氫鉀溶液、磷酸二氫鈉溶液等,對硫辛酸色譜峰的影響。結果表明,乙腈∶0.15%磷酸作為流動相,硫辛酸的分離效果較好,拖尾因子較小,峰型良好,柱效較高,同時液相系統配制較為簡便。

本研究采用反相高效液相色譜法,建立的硫辛酸膠囊含量的測定方法。具有操作簡單,重復性好的優點,具有較強的專屬性和準確性,適合于硫辛酸的含量測定。

筆者也考察了60℃下硫辛酸的高溫影響因素實驗,但硫辛酸的熔點為60～61℃,硫辛酸在穩定性實驗箱中融化,因此本研究高溫實驗選擇在40℃下檢測。高溫(40℃)、高濕對硫辛酸基本沒有影響。但在強光照射下含量明顯下降并伴有顏色改變,說明硫辛酸對強光照射比較敏感,最好避光放置。并且經過加速實驗及長期實驗考察,結果表明硫辛酸膠囊穩定性良好。

[1] REED L J.A trail of research from lipoic acid to alpha-keto acid dehydrogenase complexes[J].J Biol Chem,2001,276 (42):38329-38336.

[2] PACKER L,WITT E H,TRITSCHLER H J.Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant[J].Free Radic Biol Med, 1995,19(2):227-250.

[3] SMITH A R,SHENVI S V,WIDLA M,et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress[J].Curr Med Chem,2004,11:1135-1146.

[4] MAY J M,QU Z C,NELSN D J.Uptake and reduction of alpha-lipoic acid by human erythrocytes[J].Clin Biochem, 2007,40(15):1135-1142.

[5] 湯春芳,劉云國,徐衛華,等.硫辛酸的研究概況[J].中國生化藥物雜志,2005,26(1):52-55.

[6] TEICHERT J,PRISS R.Determination of lipoic acidin human plasma by high performance liquid chromatography with electrochemical detection[J].J Chromatogr B Biomed Appl, 1995,672(2):277-284.

[7] TEICHERT J,PREISS R.High-performance liquid chromatographic assay for alpha-lipoic acid and five of its metabolites in human plasma and urine[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2002,769(2):269-281.

[8] BERNKOP-SCHNURCH A,REICH-ROHRWIG E,MARSCHUTZ M,et a1.Development of in human release dosage form for α-Lipoic Acid.II.evaluation in human volunteers [J].Drug Dev Ind Pharm,2004,30(1):35-41.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.027

Content Determination of Alpha Lipoic Acid Capsule and Its Stability Study

MA Hong-da,HU Bei,WU Qiong,CUI Ying-yu,SHI Guo-bing
(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Area Command,Shenyang 110016,China)

Objective To establish RP-HPLC method for content determination of alpha lipoic acid tablets and investigate its stability.MethodsThe RP-HPLC method was performed on an iamonsil C18column with a mobile phase of acetonitrile-0.15%phosphoric acid(38∶62).The detection wavelenth was set at 220 nm.The stability was investigated by stressing testing,accelerated testing and long-term testing.ResultsThe linearity range of pidotimod was 5-500 μg·mL-1,and the average recovery was 99.23%.Alpha lipoic acid is light sensitive,but stable in the marketed packaging.The precision and stability conform to the requirements.ConclusionThe RP-HPLC method is simple,accurate and reproducible,and can be used to determine the content of alpha lipoic acid.Alpha lipoic acid can be stored under the room temperature by avoiding sunlight.

Alpha lipoic acid;Content determination;Stability;RP-HPLC

R977;R927.2

A

1004-0781(2014)03-0367-03

2013-06-06

2013-08-01

馬宏達(1976-),男,遼寧新民人,主管藥師,博士,研究方向:藥劑學。電話:024-28851751,E-mail：mahongdamahongda@163.com。

史國兵(1966-),男,山東文登人,主任藥師,博士,研究方向:臨床藥學。電話:024-28856262,E-mail：sysgb@126.com。