丹參酮ⅡA衍生物的合成與放射增敏活性測定*

李光強，趙潔，沈秀，周則衛，徐文清

(北京協和醫學院、中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

丹參酮ⅡA衍生物的合成與放射增敏活性測定*

李光強，趙潔，沈秀，周則衛，徐文清

(北京協和醫學院、中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

目的 對丹參酮ⅡA進行結構修飾,以期得到放射增敏效果較好的衍生物。方法通過曼尼希反應在丹參酮ⅡA的16位引入不同的小分子胺,通過EI-MS、1HNMR確證化合物結構,通過噻唑藍(MTT)法測定其對Hela細胞的半數抑制濃度(IC50)及20%抑制濃度(IC20)值,初步評價幾種衍生物的放射增敏活性。結果得到丹參酮的5個化合物,其中4個未見文獻報道。其中3個進行了放射增敏活性測定,發現在16位引入芳香環的衍生物C5放射增敏效果增強。結論在16位引入芳香環可能是提高藥物放射增敏活性的一種方式。

丹參酮ⅡA；結構修飾；輻射增敏

丹參具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養血安神的功效。現代藥理研究表明,丹參具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化、強心、降血脂、抗微生物、抗腫瘤[1-3]等。丹參酮是丹參的主要藥效成分。放射增敏作用主要針對腫瘤內放射抗拒的乏氧細胞而提出,指某些化合物能增強射線對腫瘤內乏氧細胞的殺滅作用,而對有氧的正常組織損傷小,這些化合物被稱為放射增敏藥。本課題組前期研究評價了幾種丹參酮對Hela細胞抑制作用的構效關系[4]。筆者在本實驗中擬通過曼尼希反應[5]在丹參酮ⅡA的D環上引入位阻基團和芳香基團,以期得到細胞毒性更強和放射增敏活性更高的衍生物。

1 材料與方法

1.1 試劑 丹參酮ⅡA(西安鴻生生物技術有限公司,批號:100926,純度:95.3%),胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司,批號:20121213),1640培養基(Hyclone公司,批號:NYCO828),噻唑藍[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide,MTT,天津華生源科技有限公司,批號:822A056],其他試劑均為市售。

1.2 細胞和細胞株 人宮頸癌細胞株Hela細胞購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

1.3 儀器 VG ZAB-HS高分辨有機磁質譜儀,Varian Mercury V×300型核磁共振儀,二氧化碳(CO2)培養箱(美國Themo公司),超凈工作臺(蘇州精華設備公司),TECAN-infinite M200型酶標儀,銫(137Cs)放射源,劑量率:0.78 Gy·min-1。

1.4 衍生物的合成 化合物C1的合成:稱取丹參酮ⅡA138 mg,溶于15 mL冰乙酸中,加入37%甲醛溶液150 μL,二環己胺252 μL,60℃反應16 h,萃取,旋干溶劑得到固體混合物,過硅膠柱石油醚/乙酸乙酯= 5∶1,旋干得到橘紅色主要產物50 mg,通過核磁譜及質譜進行結構鑒定。化合物C2～C5的合成類似C1。

1.5 生物實驗

1.5.1 MTT測定化合物對Hela細胞半數抑制濃度[half maximal inhibitory concentration(IC)of a substance(50% IC,or IC50)]和20%抑制率抑制濃度[20%inhibitory concentration of a substance(20%IC,or IC20)]值 取對數期Hela細胞,胰蛋白酶消化成單細胞懸液,用培養基(10%胎牛血清、90%1640培養基、青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1)稀釋成30 000個·mL-1。鋪于96孔板上,每孔加100 μL,每孔約3 000個,培養10 h后加藥[藥物設置梯度5個:25,12.5,6.25,3.1,1.6 μmol·L-1,溶解介質為培養基加1%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)] 100 μL(每個藥物梯度設置復孔5個),分別培養24,48, 72 h。培養結束后每孔加MTT20 μL,繼續培養4 h,吸凈板孔內的培養基,每孔加DMSO 150 μL,搖床震蕩10 min, 490 nm處測其吸光度(A)值。統計軟件計算IC50和IC20。

1.5.2 MTT法測定衍生物的放射增敏活性 取對數期Hela細胞,胰蛋白酶消化成單細胞懸液后,用培養基(10%胎牛血清,90%1640培養基,青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1)稀釋至30 000個·mL-1。鋪于96孔板上,每孔加100 μL,每孔約3 000個,培養10 h后加藥(每個藥設置復孔5個,藥物濃度為IC20濃度值)設置5組,培養12 h后分別照射0,1,2,4,6 Gy。繼續培養12 h,培養結束后每孔加MTT20 μL,繼續培養4 h,吸凈板孔內培養基,每孔加DMSO150 μL,搖床震蕩10 min, 490 nm波長處測A值。單因素方差分析比較照射給藥組和單純照射組,初步評價是否具有放射增敏活性。

2 結果

2.1 化學合成結果 合成得到化合物C1 50 mg,主要產物橘紅色,經查證為新化合物。EI-MS(m/z): 324.1,291.1,235.1,147.1,69.0,57.0。1H NMR (300 MHz)δ:7.61～7.58(1H,d,H-7),7.54～7.52 (1H,d,H-6),4.66(2H,s,H-17),3.18～3.14(2H,t, H-1),2.28～2.52(3H,S,H-15),1.83～1.77(3H,m, H-4),1.76～1.63(3H,m,H-4),1.33～1.27(16H,m, H-環己胺)。

化合物C2的合成,即在16位引入了一個羥甲基,經查證為新化合物。EI-MS(m/z):306.2,261.2 (100),189.1,139.1,89.0,43.0。1HNMR (300 MHz)δ:9.13～9.1(1H,d,H-1),8.41～8.38 (1H,d,H-3),7.81-7.78(1H,d,H-6),7.59～7.54 (1H,dd,H-3),7.41～7.39(1H,d,H-7),5.42(1H,s羥基-H),4.48～4.47(2H,d,H-20),2.65(3H,s,H-4),2.14(3H,s,H-18)。

化合物C3的合成方法類似C1:得到化合物C3 20 mg,產率20%。即:丹參酮ⅡA的16位引入羥甲基。EI-MS(m/z):324.1(100),235.1,165.0,128.0, 69.0,43.0。1H NMR(300 MHz)δ:7.6～7.5(2H,m, H-6 H-7),4.65(2H,m,H-3),3.17-3.13(2H,t,H-1), 2.27(3H,s,H-18),1.8～1.76(2H,m,H-2),1.66～1.63(2H,m,H-3),1.32(6H,s,H-4)。

化合物C4的合成方法類似C1,所接胺為3,4-二甲氧基苯乙胺,得到橘紅色產物,產率25%。經查證為新化合物。EI-MS(m/z):308.2,236.2,189.2 (100),164.1,103.1,76.0,43。1H NMR(300 MHz) δ:7.6～7.5(2H,M,H-6 H-7),6.57(1H,s,H-3’), 6.49(1H,s,H-6’),5.29～5.27(1H,dd,H-7’),3.773 (2H,m,H-1’),3.66(2H,s,H-21),3.18～3.14(2H, T,H-1),1.3～1.22(6H,S,甲氧基-H)。

化合物C5的合成類似C1,所接胺為2-金剛烷胺,得到產物20 mg,產率20%,經查證為新化合物。EIMS(m/z):308.3,265.3,149.1,118.9,84(100), 35.0.1H NMR(300 MHz)δ:7.6～7.5(2H,m,H-6 H-7),3.97(2H,s,H-21)3.18～3.14(2H,t,H-1), 1.77～1.57,1.33～1.29(多H,m,金剛烷胺)。

2.2 細胞抑制率實驗結果 運用SPSS12.0版軟件對MTT實驗測得的各數值進行統計分析,各化合物IC50及IC20值見表1,該部分實驗數據采用SPSS12.0版單因素ANOVA方差分析檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

表1 6種化合物對Hela細胞的抑制作用測定結果Tab.1 Inhibitory activity of six compounds against Hela cell μmol·L-1

2.3 MTT評價各化合物輻射增敏活性結果 根據丹參酮ⅡA及其合成衍生物對Hela細胞的抑制作用結果,依據48 h IC20(選取IC20值是因為在該濃度時化合物的細胞毒作用較小,測出的結果能夠更有效反映放射增敏作用),選取化合物C2,C4,C5,丹參酮ⅡA (C2A)進行測定。與對照組0 Gy(單純照射組)比較,計算各孔存活率,結果見表2。

表2 4種化合物不同劑量組照射后細胞存活率測定結果Tab.2 Results of cell surviving rate after irradiation by different doses of four kinds of compounds %

實驗表明,化合物C4照射合并給藥組對Hela細胞的抑制率顯著高于單純照射組,劑量為1,2,4,6 Gy時分別高出36.23%,25.25%,25.31%,22.98%。

3 討論

丹參酮ⅡA的A環和D環是結構修飾的兩個主要位置,而且通過修飾A,D兩個環結構,會破壞分子平面結構,這可能使分子的水溶性增加,相應的活性也增加[4]。筆者在本研究中試圖在D環呋喃環上引入空間位阻更大的胺類,實驗嘗試過引入多種胺類,但部分結果并不是預期得到的產物,胺類并沒有加上,得到的主要副產物即16位引入一個羥甲基。類似研究也有同樣的結果[6]。這可能是由于所選胺類的空間位阻太大,而且由于位阻作用所得產物的產率都比較低。根據本課題組前期工作及實驗室條件,用Hela細胞對合成的化合物進行放射增敏活性測定。生物實驗結果表明,總體上所得化合物對Hela均有一定的抑制作用。增敏實驗結果表明,與丹參酮ⅡA比較,化合物C4的放射增敏效果較好,這可能是由于C4 16位引入芳香基團的原因。由此推測,在丹參酮ⅡAD環16位引入芳香性側鏈可能會增強其放射增敏作用。這為進一步對丹參酮ⅡA進行結構修飾,以專一性提高其放射增敏作用提供了一定依據。

[1] 浦錫娟,徐凱琳.丹參的藥理作用研究進展[J].臨床醫學工程,2009,16(8):154-155.

[2] WANG B Q.Salvia miltiorrhiza:Chemical and pharmacological review of a medicinal plant[J].J Med Plants Res, 2010,4(25):2813-2820.

[3] LIN T H,HSIEH C L.Review pharmacological effects of salvia miltiorrhiza(danshen)on cerebral infarction[J].Chin Med,2010,5:22.

[4] 葉因濤,楊福軍,徐文清.丹參酮化合物對Hela細胞抑制作用與構效關系探討[J].醫藥導報,2009,28(10): 1261-1264.

[5] 江城鋒,李瑞峰,薛丹,等.丹參酮ⅡA結構修飾及其對宮頸癌hela細胞的抑制作用研究[J].天然產物研究與開發,2010,24(3)385-388.

[6] 楊東,羅厚蔚.丹參二萜醌的結構修飾[J].中國藥科大學學報,1998,29(4):255-258.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.003

Synthesis of TanshinoneⅡA Derivatives and Their Radiosensitivity Against Hela Cells

LI Guang-qiang,ZHAO Jie,SHEN Xiu,ZHOU Ze-wei,XU Wen-qing
(Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medicine Science,Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Molecular Medicine,Tianjin 300192,China)

Objective Structure modification of TanshinoneⅡA was performed in order to get tanshinone derivatives with higher radiosensitivity.MethodsStructure of TanshinoneⅡA was modified via Mannich reaction by adding different small amines at C16.The structures of the derivatives were confirmed through spectral data of EI-MS and1HNMR.The antiproliferation activities and radiosensitizing activity of TanshinoneⅡA derivatives against Hela cells were evaluated by MTT assay at IC50and IC20.ResultsFive compounds were synthesized,four of which were new.Compound C5 with an aromatic nucleus inserted at C16 had higher radiosensitivity than the prototype drug.ConclusionAdding an aromatic ring at position C16 of TanshinoneⅡA may be a good way for enhancing radiosensitizing activity.

TanshinoneⅡA;Structural modification;Radiosensitizing activity

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0283-04

2013-07-22

2013-08-20

*中國醫學科學院放射醫學研究所所內探索基金(ST1321)

李光強(1989-),男,山東濟南人,碩士,從事藥物化學研究。電話:022-85682386 E-mail：vinqiang@163.com。

徐文清,女,天津人,教授,主要研究方向:藥物化學。電話:022-85682386,E-mail：xuwenqing@irm-cams.ac.cn。