人絨毛膜促性腺激素注射日血清孕酮水平升高預測體外受精－胚胎移植妊娠率降低

江勝芳，張昌軍，徐鴻毅，董毅飛，李璟

（湖北醫藥學院附屬人民醫院，十堰442000）

控制性卵巢刺激（COS）對于體外受精－胚胎移植（IVF-ET）周期具有重要意義。關于COS過程中孕酮（P）水平對IVF-ET結局的影響，學術界一直存有爭議。2007年Venetis等［1］的一篇系統性回顧分析指出：目前尚無充分的證據支持人絨毛膜促性腺激素（HCG）注射日P水平的升高與IVF-ET臨床妊娠結局間具有相關性。2008年Bosch［2］在針對上述文章發表的評論中明確支持高P水平對妊娠結局具有不良影響的觀點。Bosch等［3］運用多變量分析發現：HCG日P升高與促性腺激素（Gn）總劑量、血清中雌二醇（E2）水平升高相關。Filicori等［4］也證實：Gn給藥的劑量與P水平呈正相關，其原因是：升高的卵泡刺激素（FSH）有助于更多的卵泡增加顆粒細胞的活性，結果引起E2和P水平升高。許多研究結論的不一致很可能是由于不同的方法引起的，比如治療的劑量、P水平的測量方法、P水平的閾值的設定。其中，設定合適的P水平的閾值是關鍵，其閾值應當通過恰當地統計分析來確定。目前多為直接設定血清P界值作為分組的依據，存在一定的主觀性。本研究采用“受試者工作特性曲線”（ROC analysis）作為研究方法，ROC曲線，又稱ROC分析，通過比較一種假設的真陽性率（TPR）和假陽性率（FPR），即比較靈敏度和特異性，評估假設的準確性和預測價值。ROC常用來確定一種特殊檢測的閾值，獲得最佳TPR而避免FPR。本研究通過對175例病例進行回顧性分析建立了COS過程中不同時間點血清P水平的ROC曲線，探討不同時間點P水平對IVF-ET治療結局的預測價值，其意義在于：如果HCG注射日P水平升高對IVFET結局存在負面影響，則需要考慮將胚胎冷凍供將來進行凍融胚胎移植，或在P水平升高前就注射HCG取卵。

資料與方法

一、研究對象

收集2010年1月至2011年8月在本院生殖醫學中心接受IVF-ET治療的病例資料。為避免不同特征人群卵巢反應性差異所致的偏差，設定納入和排除標準如下：（1）納入標準：第1次接受IVF-ET治療，年齡＜38歲，月經第2天FSH＜10U／L；采用黃體期長效促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）降調節方案；卵裂期胚胎移植。根據卵裂球數目、形態和胞漿碎片等參數進行胚胎評分，均有Ⅱ級以上的優質胚胎移植。（2）排除標準：單側卵巢；因宮腔積液、預防卵巢過度刺激綜合征（OHSS）等原因致全胚冷凍者。本研究共納入病例175例，其中132例為IVF，43例為卵胞漿內單精子注射（ICSI）周期。

二、研究方法

1．治療方案：按本中心常規，月經周期第21天肌肉注射 GnRH-a（Diphereline，3．75mg／支，博福－益普生，法國）1．3～2．3mg降調節；降調節第12～18天開始給予Gn（果納芬，Gonal-F，75U／支，默克雪蘭諾，瑞士），起始劑量為150～450U／d；3～5d后陰道超聲檢查監測卵泡發育情況并調整促排卵藥物劑量，同時至少測定COS前1d、COS第4天、COS第6～7天、HCG日4個時間點的血清P水平。當出現3個以上直徑為18mm的卵泡時肌肉注射艾澤250μg（Ovidrel，250μg／支，默克雪蘭諾，瑞士），36h后超聲引導下經陰道穿刺取卵，依據當日精液情況決定受精方式（IVF／ICSI）。受精后16～18h觀察受精，取卵后48～72h移植胚胎（≤3個），黃體酮80mg／d（浙江仙琚制藥）肌肉注射黃體支持。移植后16d測定血、尿HCG，陽性者（血β-HCG＞2．0U／L）為生化妊娠，2周后B超檢查提示孕囊或流產物病理檢查見絨毛者診斷為臨床妊娠。

2．分組和觀察指標：（1）根據IVF助孕治療結局分為妊娠組、未妊娠組。本研究中妊娠組均指臨床妊娠。（2）對COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG日4個時間點的P水平進行ROC分析，運用ROC分析評價以上4個時間點的P值對妊娠結局的預測價值。（3）根據P水平預測妊娠結局的靈敏度和特異性的指標設定P的臨界值，將病例資料分為≥臨界值組和＜臨界值組，觀察兩組的以下指標，包括年齡、不育年限、體質量指數（BMI）、基礎竇卵泡數（AFC）、GnRH-a用量、Gn應用天數、Gn應用支數、HCG日子宮內膜厚度、獲卵數、受精率、卵裂率、優質胚胎率（Ⅱ級以上胚胎數／總胚胎數）、妊娠率等，分析P可能通過何種途徑影響妊娠結局。

三、統計學分析

應用SPSS 15．0軟件進行數據錄入和處理。以“1”定義狀態變量的陽性事件（臨床妊娠陽性），以“0”定義狀態變量的陰性事件（臨床妊娠陰性），假定診斷變量值（血清P水平）越小越容易出現陽性，應用SPSS 15．0軟件繪制ROC曲線，計算曲線下面積。計量資料用均數±標準差（±s）表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0．05為有顯著性差異。

結 果

一、一般資料

175例入選對象均為移植周期。不育原因中，輸卵 管 因 素 占 57．7% （101／175），男 性 因 素 占29．1%（51／175），子 宮 內 膜 異 位 癥 占 4．0% （7／175），不明原因不育占2．3%（4／175），合并因素占6．9%（12／175）。臨床妊娠率為48．6%（85／175）。

二、COS不同時間點的P水平對妊娠結局的預測價值

以COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG日4個時間點的P值分別作為檢驗變量，以妊娠與未妊娠作為狀態變量，分別標記為妊娠“1”，未妊娠“0”，妊娠組85例，未妊娠組90例，采用SPSS 15．0軟件分析了妊娠組與未妊娠組之間優質胚胎數、優質胚胎率、移植胚胎數、移植優質胚胎數情況，結果顯示：妊娠組與未妊娠組之間優質胚胎數、優質胚胎率有顯著性差異（P＞0．05），說明兩組間胚胎質量有差異，而兩組間移植胚胎數、移植優質胚胎數無差異，說明兩組間移植的胚胎質量沒有差異。因此可以排除低質量的胚胎因素導致的妊娠失敗（表1）。在此基礎上，采用SPSS 15．0軟件分析COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG日4個時間點P水平的ROC曲線下面積（表2、圖1）。

表1 妊娠組與未妊娠組間胚胎參數比較（±s）

表1 妊娠組與未妊娠組間胚胎參數比較（±s）

注：與妊娠組相比，＊P＜0．05

組 別 例數 優質胚胎數（n） 優質胚胎率（%） 移植胚胎數（n） 移植優質胚胎數（n）妊娠組85 5．07±2．75 0．58±0．25 2．30±0．46 2．23±0．46未妊娠組 90 4．04±2．94＊ 0．49±0．26＊2．23±0．50 2．23±0．49

表2 COS不同時間點P水平的ROC曲線下面積

在不同時間點P值對妊娠結局的預測試驗中，COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG注射日4個時間點的P值的ROC曲線下面積分別為0．537（P＝0．398）、0．540（P＝0．363）、0．629（P＝0．025）、0．635（P＝0．002），提示 HCG 注射日的 P值對妊娠結局的預測有價值。

三、P臨界值的設定

以 HCG 注射日 P 值為 4．755、6．340、7．925 nmol／L為臨界值分組的妊娠組與未妊娠組例數見表3，HCG日P值分別為4．755、6．34、7．925nmol／L時，預測助孕治療結局的靈敏度、特異度指標見表4。靈敏度＝a／（a＋c），特異性＝d／（b＋d），陽性預示值＝a／（a＋b），陰性預示值＝d／（c＋d），不同界值組的abcd取值見表3。可見水平為7．925nmol／L預測助孕治療結局有較高的特異度，因此我們設定P臨界值為7．925nmol／L分組來分析兩組間的子宮內膜及胚胎因素等相關的指標，借此說明COS期間P升高通過何種途徑來影響助孕治療結局。

圖1 P值的ROC曲線下面積

表3 HCG注射日不同P值為臨界值分組的妊娠組與未妊娠組例數

四、以7．925nmol／L為P的臨界值分組比較的一般臨床情況和妊娠結局

表4 HCG注射日不同P值預測妊娠結局的靈敏度和特異度（%）

將病例資料分為HCG日P≥7．925nmol／L組和 HCG日P＜7．925nmol／L組，兩組 Gn用量、HCG日子宮內膜厚度、獲卵數、妊娠率有顯著性差異（P＜0．05）（表5）。

表5 根據 HCG日P界值7．925nmol／L分組的一般情況和妊娠結局比較［（±s），n（%）］

表5 根據 HCG日P界值7．925nmol／L分組的一般情況和妊娠結局比較［（±s），n（%）］

注：與 HCG日P≥7．925nmol／L組相比，＊P＜0．05

組 別 例數 年齡（歲） 不育年限（年） BMI（kg／m2） 基礎AFC HCG日P≥7．925nmol／L組 54 30．85±3．52 5．22±3．63 21．52±2．99 12．32±5．84 HCG日P＜7．925nmol／L組 121 30．69±4．36 4．97±3．43 22．09±2．74 13．68±6．28組 別 GnRH-a用量（mg） Gn天數（d） Gn量（支） HCG日子宮內膜厚度（mm） 獲卵數HCG日P≥7．925nmol／L組 1．46±0．26 12．04±1．26 42．65±13．71 11．28±2．56 11．30±4．17 HCG日P＜7．925nmol／L組 1．46±0．24 11．73±1．26 37．94±13．51＊ 12．42±3．05＊ 9．93±3．63＊組 別 受精率 卵裂率 優胚率 著床率 妊娠率HCG日P≥7．925nmol／L組 0．81±0．23 0．99±0．03 0．50±0．27 0．26±0．37 18／54（33．33）HCG日P＜7．925nmol／L組 0．87±0．15 0．99±0．02 0．55±0．25 0．35±0．35 67／121（55．37）＊

討 論

評價診斷價值的兩個最基本指標為靈敏度和特異度，ROC曲線就是以不同假定判斷標準條件下獲得一系列的靈敏度和特異度的值，以靈敏度為縱坐標，以1－特異度（誤診率）為橫坐標作圖所得到的曲線，并通過曲線下面積評價診斷實驗的準確性，同時便于使用者結合專業知識及篩查目的選擇最合適的臨界值［5］。需要特別注意的是：血清P值和妊娠結局之間的關系呈非線性相關時，可能會顯示非顯著性的差異，ROC曲線法可能不是最合適的分析方法［6］，或者解釋結論時須格外注意。本研究采用ROC曲線評價COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG日4個時間點的P值對妊娠結局的預測價值，結果顯示COS前1d、COS第4天、第6～7天和HCG日4個時間點的ROC曲線下面積分別為0．537（P＝0．398）、0．540（P＝0．363）、0．629（P＝0．025）、0．635（P＝0．002），根據Swets［7］的判斷標準，面積在0．5～0．7之間有較低的準確性，COS第6～7天和HCG日2個時間點的面積的95%可 信 區 間 分 別 是 0．520～0．737、0．553～0．717，不包括0．5，且P＜0．05，提示 COS第6～7天和HCG日的P值對妊娠結局有一定的預測價值。本 研 究 與 Huirne 等［8］、Bosch 等［3］、Younis等［9］的研究結論類似。Bosch等［6］最近對4 032個病例的研究發現：HCG日的P值大于1．5ng／ml（4．755nmol／L）與降低的妊娠率有顯著的相關性。本研究結果與其相似，即HCG日的P值升高導致妊娠率降低，不同之處是P值閾值與其不一致，可能是由于研究方法的差異而造成的。持相反的觀點者通過臨床試驗分析：HCG注射日即給予黃體酮支持治療，并沒有給臨床妊娠帶來負面影響，因此得出HCC注射日P水平升高對妊娠結果無不利影響的結論［10－12］。然而本研究的結果顯示：隨著超排過程的繼續，血清P水平對助孕治療結局的預測價值逐漸增大，考慮超排過程中血清P水平對IVF-ET結局的影響可能存在逐漸累加的效應，本研究結果提示不能單憑HCG注射日開始給予黃體酮支持治療并沒有給臨床妊娠帶來負面影響就確定HCC注射日P水平升高對妊娠結果無不利影響。

進行卵巢刺激前，大部分婦女經末期發生功能性溶黃體（functional luteolysis），導致黃體產生P的能力喪失，所以P水平在經期達到低谷。在使用長方案的IVF患者中，由于Gn生成抑制比較徹底，早卵泡期的P水平通常正常。不過因為黃體溶解不徹底，在早卵泡期仍然會出現P水平升高的情況［13］。Kolibianakis 等［14］、Pyrzak 等［15］的 研 究 結論：早卵泡期P水平的升高降低妊娠率，并建議對于P水平升高的患者，應取消周期或推遲至P水平低于0．7μg／L（2．219nmol／L）時開始進行卵巢刺激。本研究的結果顯示COS前1dP值的ROC曲線下面積為0．537（P＝0．398），提示COS前1d的P值對助孕治療結局無預測價值，出現這樣的結果可能是因為我中心在超促排卵治療中對于降調后P＞3．17nmol／L的患者一般認為降調未達標而取消該周期，納入本研究的病例COS前1dP均是＜3．17nmol／L。

生理狀態下，LH峰啟動卵母細胞的減數分裂，觸發卵泡細胞黃素化，促使卵細胞壁改變導致卵泡破裂，誘發排卵。在超排卵過程中，通過GnRH－a對垂體降調節，抑制內源性LH峰，避免卵泡黃素化從而提高卵母細胞質量。依據卵巢甾體激素合成的“兩種細胞兩種促性腺激素”學說認為P的合成是在卵巢的卵泡膜細胞與顆粒細胞及FSH與LH的共同作用下完成的。因此，Bosch 等［3］、Huirne等［8］、Younis等［16］認為，P水平升高代表“過早黃素化”（premature luteinization）發生，會降低卵母細胞質量，影響IVF結局。“過早黃素化”的P水平標準為＞1．2μg／L（3．804nmol／L），因為發現當 HCG日血清P水平＞1．2μg／L（3．804nmol／L）時，妊娠率和種植率下降。為了探討HCG日P水平影響助孕治療結局的機制，我們根據臨床經驗，選擇HCG日P水平4．755、6．340、7．925nmol／L作為三個分界值，計算三個分界值預測助孕治療結局的靈敏度和特異度。P＝4．755nmol／L時，預測助孕治療結局的靈敏度是83．3%，特異度是24．7%；P＝6．34 nmol／L時，預測助孕治療結局的靈敏度是65．6%，特異度是52．9%，P＝7．925nmol／L時，預測助孕治療結局的靈敏度是40．0%，特異度是78．8%。因此我們選擇具有較高特異度而靈敏度也不太低的P＝7．925nmol／L作為界值來探討HCG日P水平通過何種途徑影響助孕治療結局。

P≥7．925nmol／L組 Gn應用天數、Gn應用支數、獲卵數均大于P＜7．925nmol／L組，后兩項有顯著性差異（P＞0．05），說明超排卵過程中Gn用量大、時間長、獲卵數多者HCG日P更高。分析Gn用量大的原因有兩種可能性：（1）超排卵巢反應差；（2）起始Gn量偏大導致過多卵泡募集，較多的小卵泡發育未達標準而延長了超排時間、增加了Gn用量。而如果Gn用量大同時合并獲卵數多，超排卵巢反應差的可能性就不大了，而第二種原因的可能性更大。在臨床工作中我們觀察到，超排過程中雌激素水平上升過快、HCG日雌激素水平高的患者P水平更容易升高，因此推測超排起始Gn量偏大導致過多卵泡募集，較多的小卵泡發育不達標而延長了超排時間、增加了Gn用量，同時由于過多卵泡募集而導致雌激素水平上升過快、HCG日雌激素水平過高，最終導致P水平升高。以上關于雌激素與P的關系，只是我們觀察到的一種現象，是否是由于雌激素升高過快導致HCG日P升高還有待于進一步研究分析。眾 多 的 研 究［1，3，17－19］已 經 得 出 了 類 似 的結論：在控制性排卵周期卵泡后期，P水平的升高是由一簇發育成熟的卵泡共同分泌所致，HCG日E2水平與P水平的升高存在相關性。

我們在臨床工作中還觀察到超排過程中P升高的患者更容易獲卵。本研究結果也提示P升高的一組獲卵數更多，分析其原因除了與該組募集的卵泡數更多有關外，可能還與P升高的患者更容易獲卵有關。本研究與Segal等［20］的研究認為HCG日血清P水平升高者有更高的獲卵率和成熟卵母細胞數的結論相似。

P≥7．925nmol／L組與 P＜7．925nmol／L組比較，受精率、卵裂率、優質胚胎率均無顯著差異，說明HCG日P水平對卵母細胞質量、胚胎質量沒有影響，并不是通過影響卵母細胞質量、胚胎質量來影響妊娠結局。此結論與 Ozcakir等［21］、Younis等［9］的研究相似。究竟P水平通過何種途徑影響妊娠結局，本研究結果顯示P≥7．925nmol／L組 HCG日子宮內膜厚度小于P＜7．925nmol／L組，推測HCG日的P升高可能通過影響子宮內膜的厚度而影響其容受性，因為超排過程中P過早升高使子宮內膜減緩增殖速度而過早地向分泌期轉化，從而導致子宮內膜變薄。但是HCG日的P升高是否同時影響子宮內膜的組織形態而影響其容受性還有待于進一步的實驗研究。

本研究中HCG日P水平升高患者的助孕治療妊娠率明顯降低，P＞6．34nmol／L預測助孕治療結局的靈敏度是65．6%，說明我們在臨床超排過程中要力求控制 HCG日P值在6．34nmol／L以下。P＞7．925nmol／L預測助孕治療結局的特異度是78．8%，說明 HCG日P＞7．925nmol／lL則IVF助孕成功的可能性就很低了。至于P水平升高是受何種因素影響，怎樣控制超排過程中P水平則是下一步研究的方向。

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