氣道高反應動物模型的建立與指標檢測

張碩峰，溫麗娜，吳金英，賈占紅，丁 巖，孫建寧

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

氣道高反應動物模型的建立與指標檢測

張碩峰，溫麗娜，吳金英，賈占紅，丁 巖，孫建寧

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

目的通過重新評價卵蛋白致小鼠哮喘模型，尋找一種簡便易行的氣道高反應動物模型和相應的檢測指標，為研發治療本類疾病藥物和研究氣道高反應發病機制提供新的實驗手段。方法小鼠采用卵白蛋白（OVA）致敏；致敏后（15～21）d給予10％OVA霧化吸入激發哮喘，在末次激發24h內測量小鼠辣椒素引咳的半數有效濃度，處死小鼠取肺組織測定勻漿中NO、IL-13、ET-1的含量。結果卵蛋白致敏模型小鼠隨辣椒素濃度的升高其咳嗽反應陽性率、咳嗽次數明顯增加（與對照組相比較P＜0.01）。模型組辣椒素引咳的半數有效濃度為89.39μmol/L，對照組、地塞米松組分別為204.84、220.02μmol/L；小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13含量均明顯增加，地塞米松可明顯抑制NO的升高（與對照組相比較P＜0.01）。結論小鼠經卵蛋白致敏并連續激發7d與臨床氣道高反應性（AHR）的多種特征相似，操作簡便易行，穩定性高，故可作為氣道高反應性的模型。辣椒素引咳閾值的測定、動物肺組織中NO、IL-13、ET-1含量的變化，可作為評價模型嚴重程度的指標。

氣道高反應性；辣椒素；NO；IL-13；ET-1；小鼠

氣道高反應性（airway hyperresponsiveness，AHR）指因氣道炎癥而處于的過度反應狀態，表現出敏感而過強的支氣管平滑肌收縮反應，引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發咳嗽、胸悶、呼吸困難和喘息等癥狀。常見于上呼吸道感染恢復后期，出現咳嗽等呼吸道癥狀，可持續數周至數月，經常被誤診為支氣管炎、喘息性支氣管炎或肺炎。近年來其藥物治療已經倍受關注。但目前尚無經典的氣道高反應動物模型，人們經常針對氣道高反應發病病理過程的不同環節使用食管鹽酸滴入、臭氧吸入應激、卵蛋白致敏等動物模型替代［1，2］，缺乏系統評價。本研究試圖通過使用臨床常用的辣椒素檢測，重新評價卵蛋白致小鼠哮喘模型的氣道反應性，尋找一種簡便易行的氣道高反應動物模型和相應的檢測指標，為研發治療本類疾病藥物和研究氣道高反應發病機制提供新的實驗手段。

1 材料和方法

1.1 動物

Balb/c小鼠，雌雄各半，體重（12～14）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2006-0009，合格證號：0157200。

1.2 藥物與試劑

醋酸地塞米松片：天津太平洋制藥有限公司產品。批號：070404。規格：0.75mg/片。人用量為1～4片/次，2～4次/日；即1.5～12mg/60kg/日。小鼠受試劑量為：0.5mg/kg。氫氧化鋁（AR）：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20080428。雞卵白蛋白（OVA）：Ⅴ級（美國Sigma公司產品）。辣椒素（250mg）：美國Sigma公司，批號：00919EJ。IL-13 ELISA試劑盒：美國BG公司，批號：091202。NO ELISA試劑盒：上海森雄公司，批號：0912002。ET-1試劑盒由東直門醫院放免實驗室提供。

1.3 儀器

YLS-8A多功能誘咳引喘儀，山東省醫學科學院設備站產品。Denley Dragon Wellscan MK酶標儀：Thermo公司產品（芬蘭）。Wellwash 4 MK2洗板機：Thermo公司產品（芬蘭）。TGL-168型離心機：上海安亭科學儀器廠產品。A02AI超聲波霧化器：上海魚躍醫療設備有限公司產品。

1.4 模型的制備及分組給藥

小鼠隨機分成3組（對照組、模型組、地塞米松組）。第1日模型及給藥組每只小鼠腹腔注射20μg卵白蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁（混合于0.5mL生理鹽水中），對照組腹腔注射等量生理鹽水；第8日模型及給藥組注射20μg OVA和2mg氫氧化鋁（混合于0.5mL生理鹽水中），對照組腹腔注射等量生理鹽水。第15日開始將模型及給藥組小鼠置于封閉容器中，給予10％OVA霧化吸入激發哮喘；對照組小鼠給予等量生理鹽水，每日1次，每次30min，連續7d；并在24h內處死動物。給藥方法：從哮喘模型致敏的第8日開始，地塞米松組小鼠喂飼地塞米松0.5mg/kg/d，模型組及對照組小鼠灌服等量飲用水。

1.5 模型動物辣椒素咳嗽敏感性試驗

辣椒素30.5mg+吐溫80 1mL及無水乙醇1mL溶解，然后加入生理鹽水8.0mL，配成1mmol/L的辣椒素溶液，用生理鹽水稀釋至62.5、100、125、200、250μmol/L的5個濃度溶液。將20mL不同濃度的辣椒素分別放入多功能誘咳引喘儀的藥物池中，于末次給藥后24h內將各組小鼠放入誘咳引喘儀，引咳。從低濃度開始，依次霧化吸入上述濃度的辣椒素溶液15s（間隔10min），停止給藥，觀察開始吸入辣椒素3min內小鼠咳嗽次數，以咳嗽次數大于10次為陽性標準，計算陽性率，并行卡方檢驗；運用DAS軟件計算辣椒素引咳的半數有效濃度。

1.6 模型動物肺組織NO、ET-1、IL-13含量的測定

末次給藥后24h內，處死小鼠，取肺組織，稱重，加入生理鹽水配制成10％的勻漿，于3 000r/min離心10min，取上清液，將肺勻漿樣品于-20℃條件下凍存，備用。采用ELISA法測定勻漿中NO、IL-13的含量，采用放免法測定ET-1的含量。

1.7 統計學方法

咳嗽次數計算陽性率，并行卡方檢驗；其它數據均以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 10.0統計軟件進行分析，各組數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較方差齊者用LSD檢驗，不齊者用Dunnett's T3檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型動物對辣椒素咳嗽敏感性的測定

結果表明，隨辣椒素濃度的升高動物的咳嗽反應陽性率相映升高。經卵蛋白致敏并連續激發7d的小鼠咳嗽反應陽性率、咳嗽次數較對照組明顯增加（與對照組相比較P＜0.01）。運用DAS軟件計算辣椒素引咳的半數有效濃度，表明模型組辣椒素引咳的半數有效濃度為89.39μmol/L，對照組、地塞米松組分別為204.84、220.02μmol/L，提示小鼠經卵蛋白致敏并連續激發7d后氣道高反應性明顯升高，使用地塞米松可抑制這一反應過程（表1、2）。

表1 不同劑量辣椒素對氣道高反應模型小鼠的致咳作用的發生率（±s）Tab.1 The incidence of cough reflex induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s）

表1 不同劑量辣椒素對氣道高反應模型小鼠的致咳作用的發生率（±s）Tab.1 The incidence of cough reflex induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s）

注：*P＜0.05、＊＊P＜0.01，與模型組比較Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the model group.

組別Groups劑量Dose辣椒素（陽性動物數/動物數）Capsaicin（positive number/Mouse number） 62.5 μmol/L 100 μmol/L 125 μmol/L 200 μmol/L 250 μmol/L對照組Control group - 0/26 0/26＊＊ 1/26＊＊ 13/26＊＊ 19/26*模型組Model group - 1/26 20/26 23/26 26/26 26/26地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 0/26 0/26＊＊ 1/26＊＊ 10/26＊＊ 17/26＊＊

表2 氣道高反應模型小鼠辣椒素引咳的半數有效濃度（±s，n=26）Tab.2 ED50of cough induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s，n=26）

表2 氣道高反應模型小鼠辣椒素引咳的半數有效濃度（±s，n=26）Tab.2 ED50of cough induced by capsaicin of the mouse models of AHR（±s，n=26）

組別Groups劑量Dose辣椒素引咳半數有效濃度（μmol/L） ED50（μmol/L）對照組Control group - 204.84±19.67模型組Model group - 89.39±7.71地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 220.02±23.80

2.2 模型動物肺組織NO、ET-1、IL-13含量的測定

結果表明：經卵蛋白致敏并連續激發7d的小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13含量均明顯增加，地塞米松可明顯抑制這些指標的升高（與對照組相比較P＜0.01）。結果見表3。

3 討論

氣道反應性是指氣道對各種化學、物理或藥物刺激的收縮反應。氣道高反應性（AHR）是指氣道對正常不引起或僅引起輕度應答反應的非抗原性刺激物出現過度的氣道收縮反應。AHR引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發咳嗽、胸悶和喘息等癥狀。AHR常有家族傾向，受遺傳因素影響，但外因性的作用更為重要。目前普遍認為氣道炎癥是導致氣道高反應性最重要的機制之一［3］。故本研究選用地塞米松作為驗證模型的陽性藥［4］。

臨床上經常選用辣椒素來檢測患者的氣道反應性，且臨床研究表明辣椒素在咳嗽激發試驗過程是安全的［5］。辣椒素作為咳嗽刺激劑，它的引咳機制較為明確：主要通過興奮辣椒素敏感受體（vanilloid type 1，VR1）誘發咳嗽［6-9］。故本研究通過測定小鼠對辣椒素的敏感性，來評價其氣道反應性的高低。實驗結果表明，小鼠經卵蛋白致敏并連續激發7d后能明顯增加降低辣椒素引咳的閾值，咳嗽次數，提高咳嗽反應的陽性率，提示小鼠的氣道反應性的升高。

IL-13在AHR的發生過程中起決定性作用。研究表明，引入外源性IL-13可直接引起AHR的途徑，但是如果IL-13缺失，則ARH不能產生［10］。IL-13可激活趨化因子，誘導和加重呼吸道炎癥。IL-13直接作用于氣道平滑肌細胞產生NO，可以在沒有氣道炎癥的情況下誘發AHR［11］。IL-13還能引起呼吸道杯狀細胞增生及黏液過度分泌［12］，參與維持氣道粘膜Th2細胞因子的表達，促進嗜酸性粒細胞聚集，誘導5-脂加氧酶的表達，從而導致半胱氨酰白三烯的增加，提高氣道反應性［13］。此外，IL-13能夠促進B細胞分化，減少調亡并誘導B細胞合成過多的IgE。IgE可以介導變應性炎癥，結合許多效應細胞表面的受體，引起炎性介質的釋放，從而導致AHR和增強粘液分泌［11］。因此抑制IL-13或其受體的表達可以降低AHR。

表3 氣道高反應模型小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13的含量（±s，n=26）Tab.3 The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the mouse models of AHR

表3 氣道高反應模型小鼠肺勻漿NO、ET-1、IL-13的含量（±s，n=26）Tab.3 The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the mouse models of AHR

注：*P＜0.05、＊＊P＜0.01，表示同模型組比較。Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the model group.

組別Groups 劑量Dose NO（pg/g pro） ET-1（pg/g pro） IL-13（pg/g pro）對照組Control group - 1.70±0.79＊＊ 134.1±48.1＊＊ 297.78±49.30*模型組Model group - 15.78±4.25 395.9±79.0 341.01±46.40地塞米松組Dexamethasone group 0.5mg/kg 3.23±0.72＊＊348.4±111.7 341.38±52.94

氣道上皮細胞在各種細胞因子及環境刺激因素的作用下可分泌內皮素-1（ET-1）及基質金屬蛋白酶（MMP）并活化各種生長因子，這些因子共同作用于上皮下成纖維細胞和平滑肌細胞，使之增殖而引起氣道重塑［14］。研究認為氣道基質細胞ET-1的自分泌及旁分泌以及細胞因子與ET-1的相互作用，在AHR的形成過程中具有重要作用［15］。氣道重構是導致AHR的直接因素，此時氣道壁的厚度與氣道開始收縮的閾值成反比關系，輕微的刺激即可引起明顯的收縮反應，而輕度的支氣管收縮亦引起氣道阻力的明顯增加。NO在AHR的發生發展過程中具有雙重作用，一方面NO在氣道平滑肌張力調節和肺部免疫防御中發揮重要作用；另一方面，局部大量的NO產生可擴張支氣管粘膜血管，增強毛細管滲出，導致氣道粘膜水腫，加重氣道阻塞、組織損害，氣道平滑肌肥大、增生而使支氣管對刺激的收縮反應更強烈并最終誘發AHR［16，17］。因此NO是影響氣道重建的重要因素。

本研究結果證實小鼠經卵蛋白致敏并連續激發7d后肺組織勻漿中IL-13、NO以及ET-1含量的明顯增加。與AHR發生機制相符。

由此可見，小鼠經卵蛋白致敏并連續激發7d與臨床氣道高反應性（AHR）的多種特征相似，操作簡便易行，穩定性高，故可作為氣道高反應性的模型。辣椒素引咳閾值的測定、動物肺組織中NO、IL-13、ET-1含量的變化，可作為評價模型嚴重程度的指標。

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Establishment of mouse models of airway hyperresponsiveness and their evaluation indicators

ZHANG Shuo-feng，WEN Li-na，WU Jin-ying，JIA Zhan-hong，DING Yan，SUN Jian-ning
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

ObjectiveTo reappraise the mouse model of ovalbumin（OVA）-induced asthma and to develop a new model of airway hyperresponsiveness（AHR）and its evaluation indicators.MethodsMice were sensitized with ovalbumin（OVA）and induced asthma by inhalation of 10％OVA at 15-21 days after the sensitization.The threshold value of capsaicin cough sensitivity test，and content of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate were measured at 24 h after the last inhalation.ResultsThe positive rate of cough reflex aroused by capsaicin was significantly increased with the raise of concentration of capsaicin（compared with the control group，P＜0.01）.The ED50of capsaicin cough of the model group was 89.39 μmol/L，significantly lower than that of the control group（204.84 μmol/L）and dexamethasone group（220.02 μmol/L）.The contents of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate of the model group were significantly increased，and dexamethasone significantly inhibited the increase of NO（compared with the control group，P＜0.01）.ConclusionsThe characteristics of the OVA-sensitized mouse model are resemble to that of clinical airway hyperresponsiveness.This model is simple to generate and stable，therefore，can be used as a model of AHR.The threshold value of capsaicin cough sensitivity test and the content of NO，ET-1，IL-13 in the lung homogenate can be used to evaluate the disease severity of the mouse models.

Airway hyperresponsiveness；Capsaicin；NO；IL-13；ET-1；Mouse

R33

A

1671-7856（2014）02-0020-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.005

北京中醫藥大學科研創新團隊資助項目（編號：2011-CXTD-12）。

張碩峰（1969-），男，副教授，研究方向：中藥防治重大疾病創新藥物研究，E-mail：shuofengzhang@sina.com。

孫建寧（1952-），女，教授，研究方向：中藥防治重大疾病創新藥物研究，E-mail：jn_sun@sina.com。

2013-12-05