大鼠心肌梗死模型構建和評價方法的改良

楊濤濤，肖 穎，奚賽飛，馬毅超，方明筍，壽旗揚，潘永明，陳民利

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053）

大鼠心肌梗死模型構建和評價方法的改良

楊濤濤，肖 穎，奚賽飛，馬毅超，方明筍，壽旗揚，潘永明，陳民利

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053）

目的優化和改良大鼠心肌梗死模型的構建和評價方法，提高模型的可靠性和穩定性。方法取雄性SD大鼠結扎左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，在模型的構建過程中從麻醉、插氣管、保溫、手術操作、術后護理等環節進行優化和改進，并觀察不同的麻醉方法和術后時間對心肌梗死程度的影響，用不同的染色方式進行心肌梗死模型的評價。結果對比大鼠心肌梗死模型構建過程中各組大鼠麻醉時間、術后恢復以及心肌梗死面積的結果，戊巴比妥鈉是更合適的麻醉藥；結扎手術后時間對模型心肌梗死范圍無明顯影響（P＞0.05），但心肌缺血危險區面積隨術后時間的延長明顯減少（P＜0.01）；TTC與依文思藍雙重染色相對TTC染色能明顯觀察到心肌缺血危險區和梗死區范圍。結論優化和改進后的大鼠心肌梗死模型，提高了動物福利，制備和評價方法更加客觀準確。

大鼠；心肌梗死模型；方法；改良

心肌梗死是一種嚴重的心血管系統疾病，已成為中老年人群死亡的主要病因之一。心肌梗死動物模型是研究梗死性心臟病病理機制和相關治療藥物療效評價的一個重要手段，而心肌梗死面積（myocardial infarct size，MIS）的大小是評價梗死程度的關鍵指標之一［1］。采用手術結扎冠狀動脈降支造成大鼠急性心肌梗死是目前公認的心肌梗死經典動物模型［2］，但由于模型制作過程中受如麻醉、插氣管、保溫、手術方法和術后護理等各個環節影響以及梗死心肌自身的病理生理特點［3］，存在模型制作和術后動物死亡率高，心肌梗死面積個體差異大等問題。本研究在以往的工作基礎上，對結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型的制作過程（包括麻醉、插氣管、手術操作、術后護理以及心肌染色等環節）進行優化和改進，并觀察不同的麻醉方法和術后時間對心肌梗死程度的影響，用不同的染色方式進行心肌染色，探討其合理的評價方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體重220g～250g，中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司［生產許可證：SCXK（滬）2012-0002］；飼養在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障系統［SYXK（浙）2012-0002］，環境溫度：（20±2）℃，相對濕度：50％～60％，光照：（150～200）LX，12h/12h明暗交替，噪間＜50db；并在實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑

戊巴比妥鈉：25g/瓶，含量≥99.0％，批號：WS20120112，德國進口分裝，上海西唐科技有限公司；水合氯醛：分析純250g/瓶，批號：20120315，上?；瘜W試劑采購供應五聯化工廠；異氟烷（isoflurane）：100mL/瓶，產品批號：120203，魯南貝特制藥有限公司；氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）：10g/瓶，批號：20120905，中國華東師范大學化工廠；伊文思藍（Evans blue）：10g/瓶，批號：W20110325，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖G-10（regular agarose G-10），100g/瓶，批號：111935，法國Biowest公司；青霉素鈉：80萬U/瓶，批號：120422，廣州白云山天心制藥股份有限公司；氯化鉀：分析純AR，500g/瓶，批號：F20090409，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

Summit小動物麻醉呼吸機，美國Summit公司；AL204-電子分析天平，瑞士Mettler公司；Gaymar恒溫手術臺，美國HallowelL公司；Model 994超低溫冰箱，Thermo Scientific公司；DK-600型電熱恒溫水槽，上海精密實驗設備有限公司；HP-LaserJet M1213nf MFP掃描儀，美國惠普公司。手術器械包（手術剪、頭和直頭止血鉗、彎形鑷子、顯微持針器、開胸器、手術線、干棉花、酒精棉、紗布、頭皮針、注射器、三通管、棉線），6-0無菌醫用非吸收性縫合線無損傷縫合針，杭州富陽醫用縫合針線廠。

1.4 方法

1.4.1 手術方法：雄性SD大鼠麻醉、手術區剃毛后，固定在45°～60°斜臺，將上切牙固定在鼠板邊緣，光源照亮頸喉部有利于顯露聲門，行無創經口直視氣管插管，口腔鏡有霧氣檢查插管成功；待大鼠呼吸平穩后轉移至恒溫手術臺（36～38）℃，仰臥位固定在鼠板上，手術區擦聚維酮碘消毒，連接呼吸機，呼吸比2：1，潮氣量30mL/kg，呼吸頻率60～65次/min，大頭針穿刺左右前肢皮下，連接心電圖機測肢體Ⅱ導聯心電圖。大鼠呼吸平穩后，沿左胸骨2mm處切開皮膚約（2～2.5）cm，第三、四肋骨間隙鈍性分離肋間肌，開胸器撐開肋間隙擴大手術視野。小心地撕開心包膜暴露心臟，消毒棉輕輕固定好，于左心耳下緣2mm～3mm處用6-0無創縫合針結扎左冠狀動脈前降支，進針深度約2mm，結扎跨度（2～3）mm，做兩次外科手術結扎打結。結扎后肉眼可見結扎局部和左心室前壁呈灰白至紫紺，或Ⅱ導聯心電圖S-T段抬高并持續15min以上則為心肌梗死結扎成功標志。結扎后逐層縫合胸腔，并預留留置針以防止發生氣胸，抽胸腔負壓（抽取時注意避免留置針針頭吸住腔壁），排除胸腔內空氣，恢復自主呼吸。待大鼠呼吸穩定后，放入恢復籠內飼養（房間溫度24℃～26℃），腹腔注射5mL生理鹽水補液后，觀察并及時清除氣管痰液；待大鼠蘇醒后肌內注射0.5mL（8×104）U青霉素鈉以防感染，次日轉移至術后飼養室進行正常飼養。

1.4.2 大鼠分組：雄性SD大鼠80只適應飼養后隨機分為8組：不同麻醉藥物試驗30只，即：戊巴比妥鈉、水合氯醛、異氟烷每組各10只；兩種染色方法試驗20只，即TTC染色、TTC與依文思藍雙重染色各10只；術后造模時間試驗30只，即造模后1d、3d和7d組各10只。

1.4.3 麻醉方法：（1）藥物麻醉：實驗前大鼠禁食2h以上，根據實驗室常用麻醉劑量腹腔注射麻醉大鼠：戊巴比妥鈉（45mg/kg）和水合氯醛（300mg/kg）。記錄大鼠麻醉誘導時間和持續時間。偽手術組大鼠也采用戊巴比妥鈉麻醉（麻醉誘導時間是指從注射開始到動物進入麻醉狀態，麻醉持續時間是指進入麻醉狀態至術后蘇醒；以有無翻正反射作為大鼠麻醉與否的評定標準）。（2）氣體麻醉：實驗前大鼠禁食2h以上，放進呼吸機麻醉盒內通入1.5％異氟烷混合氧呼吸麻醉，手術全程以1％異氟烷混合氧持續麻醉。記錄大鼠麻醉誘導時間和停止1％異氟烷混合氧通入后的麻醉持續時間。

1.4.4 染色方法：（1）TTC染色：大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔麻醉后，迅速取下心臟用生理鹽水沖洗除去血污，用濾紙吸干后稱取全心重（whole heart，WH），剔除右心室、心房心肌組織，濾紙吸干，稱取左心室重量（left ventricle，LV）。然后放入-20℃冰箱中冷凍20min，切片，垂直于心臟長軸將心室部分每隔2mm橫斷切成5片，置入1％TTC溶液中，37℃避光孵育15min，染色過程不時搖動使染色液與心肌片充分接觸（TTC溶液用pH 7.4～7.8的磷酸緩沖液配制），染色完成后立即沖洗去多余的染料。TTC染為紅色的為心肌非梗死區（non-infarct size，NIS），灰白色為梗死區（infarct size，IS）。掃描拍照，用Image J軟件統計分析心肌梗死面積。梗死區面積為梗死區（IS）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比。（2）TTC與伊文思藍雙重染色：大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉后氣管插管接呼吸機，打開胸腔小心地往右心室注入5％伊文思藍（Evans blue）染液2mL，觀察2min，待大鼠鞏膜染藍后，立即向右心室注入10％KCl溶液使心臟停止跳動，迅速取下心臟，用濾紙吸干后稱取全心重，然后立即置入2％瓊脂糖PBS緩沖液中，約2min后取出，剔除右心室、心房心肌組織，濾紙吸干，稱取左心室重量（LV）。然后放入-20℃冰箱中冷凍20min，切片，垂直于心臟長軸將心室部分每隔2mm橫斷切成5片，置入1％TTC溶液中，37℃避光孵育15min。染色過程不時搖動使染色液與心肌片充分接觸（TTC溶液用pH 7.4～7.8的磷酸緩沖液配制），染色完成后立即沖洗去多余的染料。伊文思藍染為藍色為正常區（normal area，NA），TTC染為紅色的是缺血仍存活組織，成為危險區（area-at-risk，AAR），灰白色為梗死區（infarct size，IS）。掃描拍照，用Image J軟件統計分析心肌缺血區和梗死區面積。缺血區面積為危險區（AAR）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比，梗死面積為梗死區（IS）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比。

1.4.5 造模后時間：SD大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉后，行心肌梗死造模手術，次日將術后存活的大鼠隨機分為1d（即次日）、3d和7d組：即分別在造模后1d、3d和7d按方法取樣操作，TTC與伊文思藍雙重染色法心肌染色，掃描心肌片并統計分析。

1.5 統計學方法

Image J軟件統計分析心肌組織各區域的面積，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量數據采用平均值±標準差（±s）表示，檢驗方法采用Oneway ANOVA分析和T檢驗。

2 結果

2.1 麻醉效果

由表1可見，不同的麻醉藥的誘導時間和持續時間各有差異，異氟烷組為大鼠連續吸入麻醉，麻醉誘導時間較長，停止吸入后麻醉的持續時間較短；水合氯醛組與戊巴比妥鈉組為一次性腹腔注射麻醉；水合氯醛組大鼠麻醉誘導時間較短，而持續時間較長。模型建立的手術操作和術后護理至次日，異氟烷組大鼠全部存活，水合氯醛組術后至次日死亡3只，戊巴比妥鈉組大鼠死亡1只。

表1 不同麻醉的效果（±s）Tab.1 The effect of different anesthesia（±s）

表1 不同麻醉的效果（±s）Tab.1 The effect of different anesthesia（±s）

注：異氟烷組大鼠放在麻醉盒內通1.5％異氟烷混合氧吸入麻醉，且手術全程以1％異氟烷混合氧持續麻醉。Note：The rats of isoflurane group were placed inside the anesthesia box with 1.5％isoflurane and oxygen mixed inhalation，and 1％isoflurane and oxygen was used during the whole operation.

組別Groups 劑量Dose方法Method數量Number誘導時間（s） Induction time持續時間（min） Duration time次日存活Next day survival戊巴比妥鈉組Sodium pentobarbital 45mg/Kg 腹腔注射Intraperitoneal injection 10 183±26 143±37 9水合氯醛組Chloral hydrate 300mg/Kg 腹腔注射Intraperitoneal injection 10 101±18 240±53 7異氟烷組Isoflurane 1.5％ 吸入Inhalation 10 254±35 26±8 10

2.2 不同麻醉方法對梗死面積的影響

心肌掃描圖與Image J軟件統計分析結果，各組可見明顯的心肌梗死區；水合氯醛組與戊巴比妥鈉組大鼠心肌梗死范圍都明顯高于異氟烷組（P＜0.01），水合氯醛組高于戊巴比妥鈉組。見圖1、圖2。圖1見彩插4。

2.3 不同染色方法的心肌染色效果

由心肌掃描圖可見，TTC染色組心肌片能觀察到2種顏色區域：紅色區域（心肌非梗死區）和灰白色區域（心肌梗死區），而TTC與伊文思藍雙重染色組能清晰觀察到3種顏色區域：藍色區域（正常心肌區）、灰白色區域（梗死區）和紅色區域（缺血仍存活組織，危險區），各區域顏色對比觀察明顯。見圖3、圖4。圖3見彩插4。

2.4 造模后不同時間對梗死面積的影響

造模后，次日存活的大鼠沒有出現死亡的情況，精神狀態尚可，飲食排泄正常。造模后1d、3d、7d組，各組大鼠心肌梗死區面積差異不大，隨著術后時間的延長有增加趨勢，但無明顯差異（P＞0.05），而大鼠心肌缺血危險區面積則隨著術后時間的延長明顯減少：與造模后1d組相比，3d組大鼠缺血危險區/左心室減少（P＜0.05），造模后7d組大鼠缺血危險區/全心和危險區/左心室均明顯降低（P＜0.01），見圖5、圖6。圖5見彩插4。

注：與異氟烷組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖2 不同麻醉藥對大鼠心肌梗死范圍影響Note：Compared with the isoflurane group，#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.2 Effect of different anesthesia methods on rat myocardial infarct size

注：與TTC染色組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖4 不同染色方法對大鼠心肌缺血和梗死范圍影響Note：Compared with the TTC staining group，#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.4 Effect of different staining on the rat myocardial AAR and IS

注：與造模后1d組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖6 造模后不同時間對大鼠心肌缺血和梗死范圍影響Note：Compared with the 1d postoperation group；#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.6 Effect of different days post-operation on rat myocardial area-at-risk and infarct size

3 討論

成功制備心肌梗死動物模型是研究心肌梗死類疾病病理機制和治療藥物的重要環節［4］，麻醉、插氣管、保溫和造模手術過程以及術后護理等各個環節精細程度，都直接影響心肌梗死模型制備過程中動物的死亡及心肌缺血/梗死程度［3］。本文主要對冠脈結扎法制備心肌梗死大鼠模型過程中各環節進行了優化和改進，采用經口直視氣管插管，避免切開頸部皮膚插氣管引進的創傷和感染，插氣管操作要一次成功，避免多次操作傷害氣管組織，即便重復插氣管操作成功，也會刺激氣道組織分泌痰液等造成大鼠呼吸不暢導致死亡；手術過程的恒溫保溫臺，以及術后給大鼠蘇醒前的保溫措施，避免了溫度對手術建模和恢復過程的影響；切開皮膚分離肋間肌暴露心臟過程盡量使用鈍性分離，以減少組織出血和對肺部的損傷；開胸器撐開肋骨以擴大手術視野，結扎操作一定要在胸腔內完成，切勿拉出大鼠心臟進行操作，以免心臟移位、動脈扭曲造成血液循環障礙；術后護理采取的補水、注射抗生素和祛痰等步驟，能補充代謝所需的體液、預防感染并及時清除呼吸道分泌物提高造模大鼠的成活率和恢復狀態；大鼠蘇醒后轉移到保溫籠，暗室中單只飼養，防止大鼠相互抓咬，減少應激，降低術中或術后恢復過程中動物死亡［5］。

戊巴比妥鈉、水合氯醛和異氟烷是目前動物實驗研究中常用的麻醉藥，楊簡、王波、錢麗萍等分別用戊巴比妥鈉、水合氯醛和異氟烷在大鼠心肌缺血/梗死實驗研究中取得較好效果［6-8］。但許多關于大鼠心肌梗死模型的文獻資料對缺血/梗死范圍報道差異較大，本實驗對該三種麻醉藥進行對比試驗，發現以1％異氟烷混合氧持續麻醉，手術過程平穩，術后蘇醒和恢復較快，但心肌的梗死范圍較小，這可能與文獻報道的異氟烷對大鼠缺血性心肌有保護作用有關［9-10］；而300mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉持續時間長，手術過程順利，但術后恢復較慢，且心肌梗死比較嚴重，在術后大鼠蘇醒過程中有一定的死亡率，這可能與水合氯醛麻醉持續時間較長加上模型自身的病理特點導致大鼠基礎代謝差造成機體能量供應不足有關［11］；與水合氯醛麻醉比較，戊巴比妥鈉45mg/Kg腹腔注射麻醉持續時間較短，完全滿足了造模手術的全部過程操作，且術后恢復相對較快，術中和術后恢復過程動物死亡低。因此，在大鼠心肌梗死模型制備中，戊巴比妥鈉是三種麻醉藥中更合適的麻醉藥。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是一種脂溶性光敏感復合物，常用作染色劑檢測哺乳動物組織的缺血梗塞，它與組織中脫氫酶反應產生紅色的脂溶性甲，但梗死組織中脫氫酶活性下降不能與其反應，故不被染色呈蒼白色［7］。伊文思藍作為常用的偶氮染料制劑，因其分子量大小與血漿白蛋白相近而與血漿白蛋白有很高的親和力，因此非梗死區會被染成藍色，而梗死區不被染色［12］。我們參閱資料［13-15］并試驗發現TTC與伊文思藍雙重染色能明顯觀察到正常心肌區域、缺血危險區和梗死區：正常心肌組織被依文思藍染為藍色，缺血危險區被TTC染為紅色，而梗死區不著色呈灰白色，三種顏色更方便觀察和統計分析；且本實驗采用2％瓊脂糖凝膠固化伊文思藍，避免在TTC染色中脫色而造成缺血面積過大的誤差。采用雙重染色法觀察大鼠造模后1d、3d和7d心肌組織，結果發現手術后時間對心肌梗死范圍無明顯影響，但對心肌缺血危險區的影響較大：手術后3～7d，隨時間的延長心肌缺血危險區面積逐漸減少。這可為后續關于缺血/梗死類心臟疾病的病理生理以及相關藥物開發研究的起始時間提供依據和指導。

綜上所述，本實驗主要對大鼠心肌梗死模型制備過程中麻醉、插氣管、保溫、手術操作、麻醉藥物、染色方法以及造模后不同時間進行對比研究表明，戊巴比妥鈉是三種麻醉藥中更合適的麻醉藥，TTC和伊文思藍染雙重染色對心肌各區域范圍評估更為準確，且在造模后（3～7）d是開展相關研究的適宜階段。本實驗結果對大鼠心肌梗死模型制備及其評價方法的規范化以及后續研究工作提供了較好的借鑒和實踐依據。

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Improvement of the methods of establishing and evaluating rat models of myocardial infarction

YANG Tao-tao，XIAO Ying，XI Sai-fei，MA Yi-chao，FANGming-sun，SHOU Qi-yang，PAN Yong-ming CHENmin-li（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo optimize the method of establishing and evaluating rat models of myocardial infarction，and improve the reliability and stability of the model.MethodsThe left descending coronary artery in male SD rats was ligated to establish myocardial infarction model.Some important steps such as anesthesia，tracheal intubation，heat insulation，operation technique and postoperative care were improved during the modeling，and the effect of different anesthesia and different postperative days on myocardial infarction size was observed.Different staining methods were used to evaluate the infarction size in the rat myocardial infarction model.ResultsBy comparing the anesthesia time，postoperative recovery and infarction size of each group during the process of myocardial infarction modeling，the sodium pentobarbital was shown to be more appropriate anesthetic.Different days after ligation had no significant effect on the modeling of myocardial infarction（P＞0.05）；but the myocardial ischemia area was significantly decreased with longer postoperative duration（P＜0.01）.2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）and Evans blue double staining clearly visualized myocardial ischemia area and infarction area compared with TTC staining.ConclusionsThe optimized rat models of myocardial infarction in this study improve the animal welfare，and the establishing and evaluating method is more objective and accurate.

Rat；Myocardial Infarction；Model；Method；Improvement

陳民利（1963-），女，教授、碩士，研究方向：實驗動物與比較醫學，E-mail：cmli991@aliyun.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0046-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.011

浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目（編號：ZWR2008-43）。

楊濤濤（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與比較醫學，E-mail：tigood@163.com。

2013-11-29