水基鉆井液對諸氏鯔蝦虎魚抗氧化酶的影響

蔡文超，陳小曲，李建軍，黃 韌

（廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣州510663）

水基鉆井液對諸氏鯔蝦虎魚抗氧化酶的影響

蔡文超，陳小曲，李建軍，黃 韌

（廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣州510663）

目的研究我國南海區(qū)某海洋鉆井水基鉆井液對諸氏鯔蝦虎魚抗氧化酶的影響。方法在19.75～158mg/L濃度下，對3月齡諸氏鯔蝦虎魚染毒，并用試劑盒法測定超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性。結(jié)果SOD對水基鉆井液的毒性暴露不太敏感，在染毒第1天只有最低濃度組受到一定程度的抑制，染毒第2天各濃度組酶活性均受到一定程度的誘導(dǎo)（12.4％～25.5％），這種誘導(dǎo)作用在第4天即有所減弱，之后酶活性的變化變緩。CAT則對水基鉆井液表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。染毒第1天，各組酶活性均受到明顯的誘導(dǎo)，并且各組酶活性表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。最高濃度組酶活性最大誘導(dǎo)率達(dá)到97％（P＞0.05）。隨后蝦虎魚CAT酶活性逐漸下降，第7天，各染毒組酶活性的抑制率達(dá)到58.4％～89.1％。結(jié)論CAT在中毒反應(yīng)中表現(xiàn)出了敏感性，具備了作為生物標(biāo)志物的重要條件，有望在今后的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮作用。

水基鉆井液；諸氏鯔蝦虎魚；生物毒性；SOD；CAT

魚類常常作為水體污染監(jiān)測的受試生物。當(dāng)水體出現(xiàn)污染時，魚類的內(nèi)環(huán)境就會發(fā)生各種變化，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。眾多污染物中，一些有機(jī)污染物由于毒性大、難以降解等特性，影響機(jī)體正常的代謝，對生物體帶來持久性毒性。抗氧化酶是生物體中一類毒物敏感反應(yīng)大分子，常常用于污染物毒性檢測，這些抗氧化酶的活性變化在一定程度上反映了生物中毒的程度以及污染物的濃度水平。研究發(fā)現(xiàn)，接近河口的鯡魚（Sprattus sprattus）仔魚SOD和CAT酶活性明顯較高（P＜0.05），同時此處的浮游生物總PCBs和p，p'-DDE的含量也最高（P＜0.05）［1］。

石油開發(fā)污染物是污染海洋環(huán)境的一類物質(zhì)，其包括生產(chǎn)水和鉆井液等物質(zhì)，對海洋生物表現(xiàn)出一定的毒性［2］。本研究利用諸氏鯔蝦虎魚（Mugilogobius chulae）為研究對象，研究了水基鉆井液對蝦虎魚肝臟CAT、SOD酶活性的影響，為進(jìn)一步篩選石油開發(fā)污染物毒性生物標(biāo)志物提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水基鉆井液來自我國南海區(qū)某石油鉆井平臺。實(shí)驗(yàn)用諸氏鯔蝦虎魚為本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)人工繁殖和養(yǎng)殖群體。實(shí)驗(yàn)仔魚為6日齡，均為同批次孵化而成（孵出時間間隔不超過24h），健康活潑，無畸形。試驗(yàn)用蝦虎魚成魚為同批次孵化并養(yǎng)殖的3月齡群體，雌雄兼有，體長（1.24±0.21）cm，體重（0.041±0.023）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒實(shí)驗(yàn)：急性生物毒性試驗(yàn)表明，該樣品對6日齡諸氏鯔蝦虎魚仔魚的96h-LC50為316mg/L（作者另文發(fā)表）。

根據(jù)半數(shù)致死濃度結(jié)果，設(shè)置鉆井液的梯度濃度（濃度分別為96h-LC50的1/16、1/8、1/4和1/2，記為C1、C2、C3和C4）并立即進(jìn)行成魚毒性試驗(yàn)。設(shè)置1個對照和4個濃度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。實(shí)驗(yàn)開始前的24h之內(nèi)不投喂。使用3L的廣口玻璃容器進(jìn)行試驗(yàn)，染毒液體積均為1.5L，每個容器中隨機(jī)放6尾諸氏鯔蝦虎魚。

染毒時間為7d。試驗(yàn)期間不充氣，投喂適量的鹵蟲無節(jié)幼體或配合飼料，保證組間投喂餌料無差異。每次取樣前24h不投喂。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第84小時更換相同濃度的新鮮染毒液或海水。試驗(yàn)期間每2天測定1次鹽度、pH和溶解氧。在第0天取6尾魚作為對照，第1、2、4和7天每天每個容器隨機(jī)取1尾作為測試魚。進(jìn)行生物學(xué)測量之后立即全魚置于-80℃冰箱凍存。所有樣品于取樣后2周之內(nèi)測完。

1.2.2 水基鉆井液對蝦虎魚酶活力的影響：用生化試劑盒測定幼魚（全魚勻漿制備酶液）過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。進(jìn)行酶活力測定時，樣品解凍后按照試劑盒的方法制備酶液。每個組織樣品在加入稀釋液后用德國IKA T10分散機(jī)2 500r/min分散40s，冷凍離心機(jī)1 500r/min離心10min，取上清液進(jìn)行酶活力測定。檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，分光光度計法進(jìn)行檢測。過氧化氫酶（CAT）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

CAT活力定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為1個活力單位（U/mgprot）；SOD活力定義為每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50％時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位（U/mgprot）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

由于魚類的抗氧化酶（如SOD）容易受到多種因素的影響，檢測結(jié)果往往存在較大波動［3］。因此，參照楊永濱等［4］的方法，以酶活性影響率（比活力）表示抗氧化酶活性的變化：酶比活力=暴露組酶活性/空白對照組酶活性。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±S.D.）的方法來表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（ANOVA），用Duncan多重比較進(jìn)行組間差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 水基鉆井液對3月齡蝦虎魚機(jī)體抗氧化酶活力的影響

水基鉆井液影響3月齡蝦虎魚SOD和CAT的酶活力，見表1和表2。

從表中的數(shù)據(jù)可以得知，SOD對水基鉆井液的毒性暴露不太敏感，在染毒之后的4d里，各染毒濃度組的酶活性與對照組差異無顯著性（P＞0.05）。直到第7天，僅有C3染毒組的酶活性與對照組差異有顯著性（P＜0.05），但C3濃度組的酶活性與其他染毒濃度組的酶活性差異無顯著性（P＞0.05）。

表1 水基鉆井液對3月齡蝦虎魚SOD活力的影響Tab.1 Effect of water based drilling fluid on SOD in 3-month-old Mugilogobius chulae

表2 水基鉆井液對3月齡蝦虎魚CAT活力的影響Tab.2 Effect of water based drilling fluid on CAT in 3-month-old Mugilogobius chulae

2.2 水基鉆井液對3月齡蝦虎魚機(jī)體抗氧化酶比活力的影響

CAT則對水基鉆井液表現(xiàn)出敏感特性。在染毒第1天，C3和C4濃度組的酶活性被誘導(dǎo)，與對照組的酶活性差異顯著（P＜0.05）。但隨后第2天酶活性恢復(fù)，第4天各濃度組酶活性被顯著抑制（P＜0.05），這種抑制作用抑制延續(xù)到第7天。

雖然CAT表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，但表4中對照組的酶活性卻有較大的變化，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，各組之間差異顯著（P＜0.05）。因此，CAT酶活性除了受到毒物的影響之外，還與其他因素有關(guān)。為了消除其他因素的影響，采用酶的比活力進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，見圖1。

圖1的曲線表明，對于SOD，在染毒第1天只有C1濃度組受到一定程度的抑制，染毒第2天各濃度組酶活性均受到一定程度的誘導(dǎo)（12.4％～25.5％），這種誘導(dǎo)作用在第4天即有所減弱，之后酶活性的變化變緩。

水基鉆井液對CAT的活性影響較強(qiáng)。染毒第1天，各組酶活性均受到明顯的誘導(dǎo)，并且各組酶活性表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。C4組酶活性最大誘導(dǎo)率達(dá)到97％。隨后蝦虎魚CAT酶活性逐漸下降，表明毒物對該酶的抑制作用越來越強(qiáng)。第4天，各染毒組酶活性的抑制率達(dá)到48.7％～58.8％，第7天，各染毒組酶活性的抑制率達(dá)到58.4％～89.1％。

圖1 水基鉆井液對3月齡蝦虎魚SOD和CAT比活力的影響Fig.1 Effect of water based drilling fluid on SOD and CAT specific activity in 3-month-old Mugilogobius chulae

3 討論

3.1 石油開發(fā)污染物對蝦虎魚酶活力的影響

魚體抗氧化酶在污染物暴露中常常產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，某些魚類的抗氧化酶（CAT和SOD）活性與水環(huán)境污染物以及浮游生物的富集的毒物含量呈正相關(guān)關(guān)系［1］，因此也可以用于一些河口等地區(qū)有機(jī)污染物（PAHs、PCBs）的檢測和分析［5］。本研究利用蝦虎魚作為水基鉆井液生物毒性檢測的受試生物，進(jìn)行了抗氧化酶動力學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，毒物對蝦虎魚的CAT和SOD的活性均可產(chǎn)生不同程度的影響，并且表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)關(guān)系。本研究中所用污染物對蝦虎魚CAT的抑制率最高可達(dá)50％以上。另外，1.0％和1.5％的石油分散液可以使非洲鯰魚（Clarias gariepinus）CAT和SOD的活性在暴露7d后顯著降低，但14d后均顯著升高［6］，顯示石油分散液對水生生物產(chǎn)生了一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)。然而，氯代苯類化合物對斑馬魚胚胎發(fā)育均有明顯抑制作用，可以造成胚胎發(fā)育畸形甚至死亡，但該類化合物對斑馬魚胚胎抗氧化酶體系（SOD和CAT）影響并不顯著［7］，氯代苯對胚胎和成魚的致毒機(jī)制以及與抗氧化酶體系的關(guān)系值得進(jìn)一步深入探討。

大彈涂魚（Boleophthalm pectinirostris）CAT的活性隨BaP濃度增加而顯著降低［8］。本試驗(yàn)中水基鉆井液的暴露試驗(yàn)結(jié)果與此相似。抗氧化酶在染毒過程中，其活性的增加是生物對毒物的適應(yīng)性反應(yīng)，以增強(qiáng)機(jī)體消除活性自由基的能力。而酶活性的降低則可以認(rèn)為水基鉆井液對生物體的脅迫已超過機(jī)體的適應(yīng)能力，酶活性的降低是該生物即將發(fā)生中毒反應(yīng)的前兆。由此可以推測，蝦虎魚在毒物的96h-LC50濃度以上將給生物帶來更大的脅迫作用。

水基鉆井液影響CAT的活性，在染毒7d后表現(xiàn)得非常明顯（P＜0.05），而SOD雖然在染毒初期表現(xiàn)出一定的活性變化，但染毒7d時與對照組無顯著差異（P＞0.05）。水基鉆井液對CAT的影響更加明顯。CAT酶比SOD表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性。Vutukuru et al等［9］在研究銅對Esomus danricus的毒性影響時，發(fā)現(xiàn)在其半致死濃度的10％～100％范圍內(nèi)，該魚的CAT比SOD更加敏感。本研究的結(jié)果與此相似。CAT在中毒反應(yīng)中表現(xiàn)出了敏感性，具備了作為生物標(biāo)志物的重要條件，有望在今后的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮作用。

3.2 影響抗氧化酶活力的其他因素

本研究中，對照組抗氧化酶CAT和SOD的活性出現(xiàn)較大的變動，表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性。一方面，表明蝦虎魚的抗氧化酶活力變化存在一定的個體差異；另一方面，研究結(jié)果說明CAT和SOD活性的變化更容易受到外界其他因素的影響，這與馮濤等［3］的研究結(jié)果有一定相似性。

另外，影響抗氧化酶活力的因素還可能有其他方面。氧化魚油可使大黃魚血清抗氧化酶CAT和SOD活性顯著升高（P＜0.05），而維生素E對這種負(fù)面影響有一定的補(bǔ)償作用［10］。有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱可以顯著降低淡水鯰魚（Heteropneustes fossilis）腦、肝臟、鰓和骨骼肌中CAT的活性；但在維生素C和甲狀腺素（T4）單獨(dú)或者聯(lián)合作用下，可以使毒性暴露魚的CAT恢復(fù)到他們的對照水平，表明兩者可以修復(fù)毒死蜱帶來的損傷［11］。因此，今后在進(jìn)行抗氧化酶研究時，應(yīng)控制注意投喂餌料的維生素含量以及甲狀腺素等其他因素的水平，防止給結(jié)果帶來干擾。

［1］Peters LD，Porte C，Livingstone DR.Variation of antioxidant enzyme activities of sprat（Sprattus sprattus）larvae and organic contaminant levels in mixed zooplankton from the Southern North Sea［J］.Mar Pollut Bull，2001，42（11）：1087-1095.

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Effect of waterbased drilling fluid exposure on the activity of antioxidant enzymes in Mugilogobius chulae

CAI Wen-chao，CHEN Xiao-qu，LI Jian-jun，HUANG Ren
（Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute，Guangzhou 510663，China）

ObjectiveTo study the effect of waterbased drilling fluid（from a drilling platform in Nanhai district，China）exposure on the activity of antioxidant enzyme in Mugilogobius chulae.MethodsThe SOD and CAT activity of 3-month-old juvenile Mugilogobius chulae were tested by reagent kit method during the exposure at 19.75 to 158mg/L concentration.Results The SOD activity of 3-month-old juveniles was not sensitive during the exposure.At the first day of exposure，the SOD activity was slightly inhibited at the lowest concentration（P＞0.05）.However，the activity was inducted（12.4％to 25.5％，P＞0.05）in all treatment at the second day.On the 7-day exposure，the change of SOD activity was limited.The activity of CAT showed high sensitivity to the drilling fluid.During the first day of exposure，the CAT activities of each treatment were inducted and they had a concentration effect.The inductivity of the highest concentration even reached to 97％（P＜0.05）.Then，the inductivity slowed down to 58.4％to 89.1％at the 7th day.Conclusion CAT，which shows an apparent sensitivity，meets the important requirement as a biomarker，and is expected to play a role in practical application in the future.

Waterbased drilling fluid；Mugilogobius chulae；Biotoxicity；SOD；CAT

蔡文超（1983-），男，碩士，助理研究員，從事海洋環(huán)境污染生物毒性監(jiān)測研究。E-mail：hopewenchao@126.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0016-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.004

1.廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（8151026005000002）；2.廣東省中國科學(xué)院全面戰(zhàn)略合作項(xiàng)目（2010B090301027）；3.廣東省科技計劃項(xiàng)目（2007B080501005，2010B030600008）。

2013-12-11