比格犬ERβ1293基因真核載體的構(gòu)建及其在HEK293T細胞中的表達和定位

甘 藝，鐘 睿，任秀梅，趙彥斌，胡仲明，劉 冰，陳 旖，孫兆增，曾 林，楊煥民，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161；4.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062）

比格犬ERβ1293基因真核載體的構(gòu)建及其在HEK293T細胞中的表達和定位

甘 藝1，2，鐘 睿2，3，任秀梅2，4，趙彥斌2，胡仲明2，劉 冰2，陳 旖2，孫兆增2，曾 林2，楊煥民1，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161；4.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062）

目的觀察比格犬Myc標簽ERβ1293重組真核表達載體在HEK293T細胞中的表達及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重組真核表達載體為模板，PCR保真酶擴增得到ERβ1293基因編碼區(qū)全長。Myc標簽ERβ1293重組真核載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，運用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blotting）和間接免疫熒光技術(shù)（indirect immunofluorescence，IF）鑒定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T細胞中的表達和定位情況。結(jié)果成功構(gòu)建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重組真核表達載體，轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中。Western blotting檢測有蛋白條帶表達，共聚焦顯微鏡下觀察IF處理后的轉(zhuǎn)染細胞，熒光定位于細胞質(zhì)。結(jié)論前期實驗得到比格犬ERβ剪切異構(gòu)體ERβ1293編碼區(qū)序列，缺失第四外顯子，導(dǎo)致其與配體結(jié)合能力減弱或消失，因此目的基因編碼蛋白定位在細胞中發(fā)生變化。

比格犬；ERβ1293；蛋白定位；第4外顯子缺失

比格犬作為國際公認的實驗用犬，為了達到國內(nèi)醫(yī)藥衛(wèi)生科研的實驗要求，提高其繁殖效率為重中之重。雌激素由卵泡顆粒細胞分泌，作為動物機體內(nèi)調(diào)控生殖系統(tǒng)最重要的激素之一，微量的游離雌激素與雌激素受體（ER）在靶細胞結(jié)合即可促進動物發(fā)情、繁殖等機體活動。雌激素與ER有同等的重要性。本課題組從比格犬下丘腦-垂體-性腺軸入手，研究ERβ及其剪切異構(gòu)體的組織分布和生物學(xué)功能。孔德強等［1］解剖發(fā)情期和間情期的比格犬，從卵巢、子宮、下丘腦、垂體四種組織中，發(fā)現(xiàn)了ERβ剪切異構(gòu)體。任秀梅［2］成功克隆比格犬ERβ及其剪切異構(gòu)體編碼區(qū)。ERβ由1593個堿基組成，編碼530aa，命名為ERβ1593。該剪切異構(gòu)體由1293個堿基組成，編碼430aa，因此命名為ERβ1293。開展本次試驗，討論成功構(gòu)建的 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重組真核表達載體在HEK293T細胞中的表達及定位情況，為更深層研究其同源二聚化和異源二聚化作用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：LA Taq、pMD18-T Vector、BamHI、XhoI、T4 DNA Ligase為 TaKaRa品牌產(chǎn)品，DNA marker 2000、DNA marker 10000、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑、2×SDS上樣緩沖液為博邁德品牌產(chǎn)品，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基為Hyclone品牌產(chǎn)品，0.25％EDTA胰酶、PBS緩沖液為Solarbio品牌產(chǎn)品、抗 Myc標簽兔單克隆抗體（GTX115046）為GengTex品牌產(chǎn)品，DNA膠回收試劑盒、抗GAPDH兔多克隆抗體（CW0101）、HRP標記兔二抗（CW0103）為康為品牌產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標記兔二抗（ZB0511）由中杉金橋分裝產(chǎn)品，胰蛋白胨、NaCl、酵母粉、脫脂奶粉、多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚、甘油、碘化丙啶、牛血清白蛋白等均為國產(chǎn)試劑。

1.1.2 菌種及細胞株：BMDH5α感受態(tài)細胞為博邁德品牌產(chǎn)品、pEGFP-N1-ERβ1293和pcDNA3.1-Myc載體保存菌種由本實驗室提供。HEK293T細胞由本實驗室凍存。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293的構(gòu)建及鑒定：上下游引物5'端分別加入酶切位點BamHI和XholI，引物序列如下：ERβ1293-F：5'-gtcaggatccatggata tcaaaaactctccatc-3'；ERβ1293-R：5'-gtcactcgagttactgagatgtggtcttctggga-3'。以pEGFP-N1-ERβ1293重組真核表達載體為模板，PCR高保真擴增目的片段，純化后構(gòu)建pMD-18T-ERβ1293，菌液PCR鑒定后測序，并結(jié)合測序?qū)I(yè)軟件對測序結(jié)果進行比對。比對正確的pMD-18T-ERβ1293與pcDNA3.1-Myc真核載體分別雙酶切處理，目的片段回收純化后連接并轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定后測序，并進行測序結(jié)果進行比對。

1.2.2 HEK293T細胞轉(zhuǎn)染：將細胞計數(shù)后適宜數(shù)量接種于6孔板中，高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含有10％FBS，無雙抗）培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2、相對濕度95％的恒溫箱培養(yǎng)。細胞鋪六孔板底70％～90％時轉(zhuǎn)染（接種后24h之內(nèi)）。將4μg pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重組真核質(zhì)粒、pcDNA3.1-Myc質(zhì)粒及10μL GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于50μL 0.15M NaCl中，輕柔混合轉(zhuǎn)染混合液，室溫靜置5min，混合液加入HEK293T細胞培養(yǎng)液中。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測目的重組真核表達載體在HEK293T細胞中的表達：轉(zhuǎn)染48h后，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）處理細胞表面，收集細胞于離心管，900r/min離心3min；每管加入50μL complete whole-cell lysis buffer，4℃全速離心20min；取上清液至新離心管，用BCA法測定上清蛋白濃度；加等體積2×SDS上樣緩沖液，旋渦震蕩；沸水浴10～15min，配制10％SDS-PAGE膠，待膠干后，每個膠孔加入等質(zhì)量蛋白，體積差由1×SDS上樣緩沖液補齊；恒電壓電泳；蛋白膠恒電流轉(zhuǎn)印至0.45μm PVDF膜；蛋白膜置于濕盒中，加入5％脫脂奶粉封閉0.5～1h后，按實驗需要剪裁蛋白膜；目的蛋白膜放入抗Myc標簽兔單抗1∶1 000稀釋液，GAPDH蛋白膜放入抗GAPDH兔多克隆抗體1∶5 000稀釋液，分別孵育4℃過夜；TBST洗膜3次，每次7min；加入HRP標記兔二抗1∶3 000稀釋液，室溫孵育1h；TBST洗膜3次，每次7min；待目的蛋白膜和GAPDH蛋白膜半干后，按原位置拼接，逐滴添加發(fā)光試劑盒A/B液等體積混合液，反應(yīng)1min，去除混合液后，即可顯影。

1.2.4 激光共聚焦掃描技術(shù)檢測pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T細胞中的定位：細胞鋪板之前在六孔板中放入適當大小的蓋玻片，轉(zhuǎn)染過程同1.2.2。以下為每孔細胞的具體操作：轉(zhuǎn)染（24～36）h后，1mL 1×Hanks液漂洗細胞爬片表面2次；1mL 4％多聚甲醛（POM，V/V）室溫固定15min，1mL 1×Hanks液漂洗2次，每次5min；1mL 0.3％聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），常溫孵育10min，1mL 1×Hanks液漂洗2次，每次5min；1mL 1％牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉細胞30min，0.5mL 1∶1 000稀釋的抗Myc標簽兔1％BSA溶液，室溫孵育2h，1mL 1×Hanks液漂洗2次，每次5min；0.5mL 1∶1 000稀釋的FITC標記兔二抗1％BSA溶液，37℃孵育lh，1mL 1×Hanks液漂洗2次，每次5min；逐滴添加50ng/mL碘化丙啶（PI），細胞核室溫漂色10min，1mL 1×Hanks液漂洗2次，每次5min，逐滴添加抗淬滅劑-50％甘油（V/V）于載玻片中央，取出爬片，細胞面貼于載玻片，避免有氣泡產(chǎn)生。用激光掃描共聚焦顯微鏡20倍鏡下觀察熒光部位。

2 結(jié)果

2.1 pMD-18T-ERβ1293菌液PCR鑒定

瓊脂糖凝膠電泳圖中有明亮的條帶在約1 290 bp的位置（圖1）。

圖1 為pMD-18T-ERβ1293菌液PCR鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoresis of bacteria PCR of pMD-18T-ERβ1293

2.2 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293的菌液PCR和雙酶切鑒定

分別得到大小為1 290 bp的基因片段（圖2-1，2-2）。

圖2-1 為pcDNA3.1-Myc-ERβ1293菌液PCR鑒定電泳圖Fig.2-1 Electrophoresis of bacteria PCR of pcDNA3.1-Myc-ERβ1293

圖2-2 為pcDNA3.1-Myc-ERβ1293質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖Fig.2-2 Electrophoresis of restriction enzyme digestion of pcDNA3.1-Myc-ERβ1293plasmid

2.3 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T細胞中的表達

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-ERβ1293有一條明顯的蛋白帶，表明 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293成功表達于細胞（圖3），分子量約為48kDa。

2.4 pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T細胞中的定位

pcDNA3.1-Myc-ERβ1293主要表達于細胞質(zhì)，細胞核無熒光（圖4A）。pcDNA3.1-Myc空載體質(zhì)粒表達于整個細胞（圖4E）（圖4見彩插1）。

3 討論

前期實驗通過對比格犬的下丘腦、垂體、卵巢、子宮四個組織進行RNA提取，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到了ERβ1293cDNA編碼區(qū)序列［2］。ERβ1293是比格犬ERβ1593缺失第四外顯子的一種剪切異構(gòu)體，由1293個堿基組成，編碼430個氨基端。ER是核受體第3亞家族（NR3）I亞群——類固醇受體超家族（SHR）中的一員［3］。雌激素通過血液循環(huán)系統(tǒng)擴散至靶細胞，與ER結(jié)合，從細胞水平調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄及靶器官的生物學(xué)功能。ER有6個功能區(qū)-A/B、C、D、E、F區(qū)。這些功能區(qū)從N端到C端排列，每個功能區(qū)對ER功能發(fā)揮都起到了特異性作用。A/B區(qū)存在活性功能區(qū)-1（activation function-1，AF-1）；C區(qū)含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD），DBD中央富含半胱氨酸；E區(qū)存在活性功能區(qū)-2（AF-2）。AF-1為配體非依賴性轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)，當DBD與DNA結(jié)合時，AF-1無需配體結(jié)合即可和多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，介導(dǎo)信號向下游蛋白傳遞，進一步激活靶基因。AF-2位于E區(qū)的配體結(jié)合域（LBD），當與不同配體結(jié)合后，其構(gòu)象因配體種類而變化，并完成DNA轉(zhuǎn)錄的激活。兩者都能夠大大提高轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。ER的生物學(xué)功能因各個功能區(qū)發(fā)揮作用時的構(gòu)象變化而不同。迄今的研究發(fā)現(xiàn)，有兩種亞型，分別命名為ERα和ERβ。ERβ是核受體的一種，其位于14q染色體，編碼530 aa的蛋白質(zhì)。而ERβ因物種和cDNA序列延長或缺失，出現(xiàn)多種剪切異構(gòu)體。目前，有文獻報道，人類［4-8］hERβ序列因羧基端被替換、第八外顯子被新序列替換、外顯子缺失或是只有部分序列表達，而導(dǎo)致編碼框移位或無翻譯轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；小鼠［9-11］mERβ因編碼框第5、6外顯子間插入序列或缺失第5、6外顯子，導(dǎo)致LBD的增長或缺失；大鼠［12-15］rERβ因LBD區(qū)增長、缺失第3外顯子，而導(dǎo)致DBD區(qū)內(nèi)雙鋅指結(jié)構(gòu)的變化，最終獲得了剪切異構(gòu)體特有的配體結(jié)合親和力、轉(zhuǎn)錄活性、二聚體形成及作用靶器官等。ERβ為NR3的I亞群中的一員，分布于細胞質(zhì)中，核轉(zhuǎn)運必須與配體結(jié)合后才會發(fā)生。還有文獻報道，在有激素刺激和無激素刺激的條件下，ERβ的定位未發(fā)生變化，均位于細胞核內(nèi)［16］。ERβ1293較ERβ缺失第四外顯子。實驗結(jié)果證實，ERβ1293基因定位于細胞質(zhì)中，而非細胞核。Richard H.Price［15］曾報道h ERβ1δ4缺失第四外顯子，h ERβ1δ4-GFP表達定位于細胞質(zhì)，并且喪失了與E2結(jié)合的能力。這種能力的喪失導(dǎo)致LBD的正常折疊的改變。本課題組前期構(gòu)建pEGFP-N1-ERβ1593、pEGFP-N1-ERβ1293，并通過IF處理轉(zhuǎn)染細胞，激光共聚焦掃描驗證了ERβ1593-EGFP定位于細胞核，ERβ1293-EGFP定位于細胞質(zhì)。［2］雖然GFP標簽可產(chǎn)生綠色熒光蛋白，便于肉眼直接觀察，但其分子量高達27kD，可能會影響目的基因的亞細胞定位。本實驗為了更精確的定位目的基因，采用編碼8個氨基酸的Myc標簽，大大降低的標簽對目的基因的定位影響。

圖3 為western blot目的蛋白表達鑒定Fig.3 Identification of the target protein expression by Western blotting

所以推測，ERβ缺失第四外顯子，導(dǎo)致其配體結(jié)合能力減弱或喪失，核轉(zhuǎn)運過程受阻，導(dǎo)致其編碼蛋白無法定位于細胞核而定位于細胞質(zhì)。ERβ1293定位于細胞質(zhì)中的哪種細胞器尚未經(jīng)試驗證實，需要通過后續(xù)的試驗繼續(xù)探索。

［1］孔德強，李愛學(xué)，曾林，等.一種比格犬雌二醇β受體剪切異構(gòu)體的克隆和序列分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，7（11）：44-47.

［2］任秀梅.比格犬ERβ剪切異構(gòu)體在下丘腦-垂體-卵巢軸的種類及其亞細胞定位［D］.吉林大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文，2013.

［3］Beato M，Klug J.Steroid hormone receptors：an update［J］.Hum Reprod Update，2000，6（3）：225-236.

［4］Pike AC，Brzozowski A.，Hubbard RE.et al.Structure of the ligand-binding domain of oestrogen receptor β in the presence of a partial agonist and a full antagonist［J］.EMBO J，1999，18（17）：4608-4618.

［5］Moore JT，McKee DD，Slentz-Kesler K，et al.Cloning and characterization of human estrogen receptor β Isoforms［J］.Biochem Biophys Res Commun.1998，247（1）：75-78.

［6］Omoto Y，Kobayashi S，Inoue S.et al.Evaluation of oestrogen receptor β wild-type and variantprotein expression，and relationship with clinicopathological factors in breast cancers［J］.Eur J Cancer，2002，38（3）：380-386.

［7］Poola I，Abraha J.Baldwin K.et al.Identification of ten exon deleted ERβ mRNAs in human ovary，breast，uterus and bone tissues：alternate splicing pattern of estrogen receptor β mRNA is distinct from that of estrogen receptor α［J］.FEBS Lett，2002，516（1-3）：133-138.

［8］Inoue S，Ogawa S，Horie K，et al.An estrogen receptor β isoform that lacks exon 5 has dominant negative activity on both ERα and ERβ［J］.Biochem Biophys Res Commun.2000，279（3）：814-819.

［9］Tremblay GB，Tremblay A，Copeland NG，et al，Cloning，chromosomal localization，and functional analysis of the murine estrogen receptor β［J］.Mol Endocrinol，1997，11（3）：353-365.

［10］Sladeka R，Beattyb B，Squireb J，et al.Chromosomal mapping of the human and murine orphan receptors ERα and ERβ and identification of a novel human ERα-related pseudogene［J］.Genomics，1997，45（2）：320-326.

［11］Lu B，Leygue E，Dotzlaw H，et al，F(xiàn)unctional characteristics of a novel murine estrogen receptor-β isoform，estrogen receptor-β 2［J］.J Mol Endocrinol.2000，25（2）：229-242.

［12］Chu S，F(xiàn)uller P.J.Identification of a splice variant of the rat estrogen receptor β gene［J］.Mol Cell Endocrinol，1997，132（1-2）：195-199.

［13］Maruyama K，Endoh H，Sasaki-Iwaoka，et al.A novel isoform of rat estrogen receptor β with 18 amino acid insertion in the ligand binding domain as a putative dominant negative regular of estrogen action［J］.Biochem Biophys Res Commun，246（1）：142-147.

［14］Petersen DN，Tkalcevic GT，Koza-Taylor PH，et al.Identification of estrogen receptor β2，a functional variant of estrogen receptor β expressed in normal rat tissues［J］.Endocrinology.1998，139（3）：1082-1092.

［15］Price R.H Jr，Lorenzon N，Handa RJ，et al.Differential expression of estrogen receptor β splice variants in rat brain：identification and characterization of a novel variant missing exon 4［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，80（2）：260-268.

［16］Mangelsdorf DJ，Thummel C，Beato M，et al.The nuclear receptor superfamily：the second decade［J］.Cell，1995，83（6）：835-839.

Expression and localization of eukaryotic expression vectors of Beagles ERβ1293gene in the HEK293T cells

GAN Yi1，2，ZHONG Rui2，3，REN Xiu-mei2，4，ZHAO Yan-bin2，HU Zhong-ming2，LIU Bing2，CHEN Yi2，SUN Zhao-zeng2，ZENG Lin2，YANG Huan-min1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071；3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161；4.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062）

ObjectiveTo construct recombinant eukaryotic expression vectors of Beagles ERβ1293，and identify the expression and localization of ERβ1293in the human embryonic renal HEK293T cells by Western blotting and indirect immunofluorecent assay.MethodsThe ERβ1293gene was amplified by PCR using pEGFP-N1-ERβ1293as a template.The recombinant eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-Myc-ERβ1293was constructed，and transfected it into HEK293T cells.The expression of pcDNA3.1-Myc-ERβ1293was detected by Western blot，and its localization was detected by indirect immunofluorecence assay.ResultsThe expression of pcDNA3.1-Myc-ERβ1293was constructed，and successfullyidentified in the HEK293T cells using Western blotting，and detected only in the cytoplasm using IF by laser scanning confocal microscopy.ConclusionsIn the previous experiment，the coding sequence of Beagles ERβ1593splice variants has been obtained，which is lack of exon 4，and its ligand binding ability is reduced or disappeared，so that the intracellular localization of ERβ1293codeing protein is changed.

Beagles；ERβ1293；Proteins localisation；Exon 4；

R33

A

1671-7856（2014）02-0007-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.002

國家自然科學(xué)基金資助項目（31172164）；十二五重大專項“高致病病源動物模型研究”（2012ZX10004502）。

甘藝（1988-），女，碩士生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)，E-mail：gy_szz@126.com。

曾林（1965-），男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：實驗動物科學(xué)與管理，E-mail：zenglin1965@126.com；楊煥民（1956-），男，博士生導(dǎo)師，研究方向：家禽生殖生理，E-mail：yanghuanmin@yahoo.com.cn。

2013-12-02