宮頸病灶HSV-2感染及其與宮頸癌的關聯性

李成德，李玲，歐麗紅，雷偉華，成卓梅，鄧超樺，李海珠，莫燕芳

(肇慶市第一人民醫院檢驗科，廣東肇慶 526020)

宮頸病灶HSV-2感染及其與宮頸癌的關聯性

李成德，李玲，歐麗紅，雷偉華，成卓梅，鄧超樺，李海珠，莫燕芳

(肇慶市第一人民醫院檢驗科，廣東肇慶 526020)

目的觀察宮頸病灶中單純皰疹病毒-2(HSV-2)感染狀況，探討宮頸HSV-2感染與宮頸癌的關聯性。方法101例宮頸病變患者中宮頸癌患者46例(癌變組)，宮頸良性疾病55例(對照組)，分別對其宮頸病灶組織和宮頸分泌物進行HSV-2 DNA(實時熒光PCR法)和人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型(快速導流雜交法)檢測。結果宮頸病灶HSV-2 DNA陽性率為10.89%；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，對照組為5.45%，兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。宮頸病灶HPV總陽性率為67.33%，共檢測出13種HPV亞型，以16型最多見(45.45%)；癌變組(97.83%)與對照組(41.82%)間比較差異有統計學意義(χ2=34.087，P＜0.001)。HSV-2與HPV合并陽性率為9.90%，HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率達100%，混合感染的亞型主要為HPV16占75%。結論HSV-2多與HPV 16亞型合并感染宮頸癌患者，其在宮頸癌演變過程中的潛在影響不能忽視。

宮頸癌；單純皰疹病毒- 2；宮頸組織；人乳頭瘤病毒

宮頸癌是導致婦科患者死亡的主要惡性腫瘤，也是目前已明確病因的極少數惡性腫瘤之一，許多研究證實HPV感染是宮頸癌的必要因素，但在致癌過程中它并非單獨起作用，還需要一些其他因素來協同或推動疾病進程。單純皰疹病毒(Herpes simplex virus-2，HSV-2)曾是最早被認為在誘發宮頸癌過程中起重要作用的一種病毒[1]，其與宮頸癌之間的關系一直存在爭議[2-7]。筆者分別對101例以病理學診斷為確診標準的宮頸病變患者的宮頸病灶組織和宮頸分泌物進行HSV-2 DNA實時熒光PCR和快速導流雜交法人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型檢測，探討HSV-2與HPV、HSV-2與HPV亞型及其與宮頸癌發生、發展之間的關聯性，為宮頸癌的預防和治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源收集2011年1月至2012年12月本院婦科臨床資料比較完整的部分手術患者101例，所有患者的沙眼衣原體、梅毒螺旋體、人類免疫缺陷病毒、Epstein Barr病毒和人巨細胞病毒病源體核酸檢測均為陰性。其中癌變組宮頸癌患者46例，年齡32～65歲，平均(42.4±14.6)歲，臨床分期參照2010年國際婦女產科協會FIGO分期系統分期：0～Ⅰ期16例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期5例；按病理分化程度：低分化癌6例，中分化癌18例，高分化癌22例。宮頸良性疾病(子宮肌瘤5例、宮頸炎15例、CIN 1級12例，CIN 2級16例和CIN 3級7例)55例作為對照組，年齡28～61歲，平均(43.1±15.2)歲，兩組間年齡差異無統計學意義。

1.2 標本采集采集患者宮頸病灶新鮮組織和宮頸分泌物標本，宮頸病灶組織即由婦科醫生經活檢或手術切除術留取子宮頸癌灶新鮮組織，用無菌剪將組織剪成薄片約0.2 cm大小3～5片，放入由凱普生物有限公司提供的有保存液的專用標本管中；宮頸分泌物標本取樣步驟和要求：先用棉拭子將陰道或宮頸口過多的分泌物輕輕擦拭干凈，再用宮頸刷緊貼宮頸口稍用力順時針旋轉2～3圈，然后放入同樣的專用標本管中；以上標本均于-20℃保存，1個月內測定。

1.3 儀器和試劑基因擴增儀為美國MJ OPTICON-2實時PCR擴增儀、HSV-2 DNA熒光定量PCR檢測試劑購自中山大學達安基因股份有限公司。醫用核酸分子快速雜交儀HHM-2型及配套HPV核酸擴增和雜交分型試劑盒均由廣東凱普生物科技有限公司提供(采用快速導流雜交法檢測6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304等21種HPV基因型)。蛋白酶K購自AMRESCO公司。

1.4 實驗方法組織標本室溫解凍后，用500 μl消化液(50 mmol/LTris，pH 8.5，200 mg/L蛋白酶K)懸浮組織，37℃反應過夜或45℃3 h。其余操作程序同宮頸分泌物標本檢測，嚴格按試劑說明書步驟進行。

1.5 統計學方法采用SPSS15.0統計軟件進行統計分析，組間陽性率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸病灶新鮮組織和宮頸分泌物檢測的結果HSV-2 DNA陽性率一致，差別僅在兩種標本檢測陽性擴增曲線出現相差0.5～2個CT值；HPV分型檢測結果完全一致。

2.2 宮頸病灶HSV-2的感染狀況HSV-2 DNA陽性率為10.89%(11/101)；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%(8/46)；以FIGO分期：0～Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的陽性率分別為6.25%(1/16)、15.38%(2/13)、33.33%(4/12)和20.00%(1/5)；以病理分化程度：低分化癌、中分化癌和高分化癌陽性率分別為16.67%(1/6)、22.22%(4/18)和13.64%(3/22)；對照組陽性率為5.45%，兩組間HSV-2陽性率差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 HPV基因分型檢測結果宮頸病灶HPV分型檢測陽性率為67.33%(69/101)，共檢測出13種HPV亞型(6、11、16、18、31、39、52、53、58、59、66、68和CP8304)，以16型最多見達45.45%。癌變組中16型占47.83%(22/46)；其余亞型以52型(15.58%)、58型(12.99%)和18型(7.79%)多見。癌變組HPV分型陽性率為97.83%(45/46)，與對照組的41.82%(23/55)間差異有統計學意義(χ2=34.087，P＜0.001)。兩個或兩個以上型混合感染為6.93%(7/101)，見表1。

表1 HPV基因分型檢測結果及檢出型別構成[例(%)]

2.4 宮頸病灶中HSV-2與HPV合并感染狀況宮頸病灶HSV-2與HPV合并陽性率為9.90% (10/101)，癌變組與對照組HSV-2與HPV合并陽性率分別為17.78%(8/45)和4.34%(1/23)，組間差異無統計學意義(P＞0.05)；HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率為100%(8/8)；與HSV-2混合感染的亞型主要為HPV16，占75%(6/8)，對照組為0。

3 討論

HSV-2屬于皰疹病毒其中一型，原發感染常引起生殖器皰疹，HSV-2具有腫瘤DNA病毒的性能，可刺激感染的宿主細胞DNA和RNA合成，導致細胞的轉變而呈現致癌能力。HSV-2 DNA還可以整合多種正常組織的DNA，使正常細胞轉化為腫瘤細胞[8]。研究[9]表明HPV感染并非唯一的宮頸癌致病因素。筆者對確診患者的宮頸病灶組織和宮頸分泌物HSV-2 DNA和HPV基因分型進行了檢測，顯示HSV-2 DNA和HPV分型結果分別完全一致，提示：(1)宮頸病變患者合格的宮頸分泌物HSV-2檢測可預示其宮頸病灶組織中HPV存在狀況；(2)宮頸病灶組織中HSV-2、HPV合并存在可能非偶然，有必要引起關注。

20 世紀中期，HSV-2與宮頸癌相關的研究主要采用抗原或抗體技術進行，HSV-2的檢出率較高。宋述梅等[8]直接用HSV-2感染移植宮頸，發現宮頸癌發生率達12.76%，他們認為不可忽視HSV-2在宮頸癌發生中的直接作用。還有研究認為HSV-2作為輔因子誘導被HPV感染宮頸上皮細胞DNA損傷或染色體異常[10]，因此HSV-2被認為在誘發宮頸癌過程中起重要作用。PCR技術出現后，相關報道顯示宮頸癌患者宮頸分泌物或組織中HSV-2 DNA檢出率高低不一[1-2，5-6，11]，因而，HSV-2在宮頸癌發生、發展中的作用爭議頗多。本研究中，101例宮頸病灶HSV-2 DNA陽性率10.89%；其中癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，以FIGO分期的癌變組Ⅲ期為33.33%，最多見。說明宮頸病變患者HSV-2的感染率不高，若由此把HSV-2視作宮頸癌發展的輔助因子的假設不容易讓人接受[12]。

1974年Zur Hausen提出了人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌發病有關的假設，1995年國際癌癥研究協會(IARC)專題討論會認為HPV感染是宮頸癌的主要病因[13]，WHO于1996年宣布HPV是引起宮頸癌變的首要因素。本實驗結果顯示在宮頸癌中HPV檢測陽性率近100%，共檢測出13種亞型，其中以16型最多見占47.83%，驗證了這一結論。

1982年Zur Hausen還提出HSV-2作為“啟動子”與HPV協同致癌學說，認為HSV-2作為“啟動子”反覆感染正常宮頸上皮，在“促進子”HPV的協同作用下致細胞惡變。該假設似乎可以解釋宮頸癌患者活檢組織中缺乏HSV-2 DNA，然而迄今尚未獲得足夠的實驗依據。本研究中宮頸病變標本癌變組HSV-2的陽性率為17.39%，HSV-2與HPV合并陽性率為9.90%，提示宮頸癌患者感染HSV-2非高概率事件，宮頸細胞中HSV-2可以與HPV感染共存，且在宮頸癌組織中檢測到兩者的DNA。有報道發現單純皰疹病毒突變是在一個裂解感染周期中的早期事件，表明宮頸細胞甚至可以由被包裝有缺陷的病毒基因組發生突變[10]。因此，盡管人群中宮頸癌的發生是低概率事件，宮頸病變患者HSV-2的感染率也不高，HSV-2在宮頸癌演變過程中的潛在影響還是不能忽視。

Matovina等[14]研究表明7.4%的宮頸病變組織中存在HPV16 DNA整合現象，且整合現象只發生在重度宮頸病變組織中，認為整合是宮頸病變進展過程中的一個重要事件，盡管此整合僅是一個隨機事件。本組研究結果顯示HSV-2感染的癌變組中HPV陽性率為100%，混合感染的HPV亞型主要為16型占75%，提示在宮頸癌患者中，HSV-2多與HPV16型合并感染。但HSV-2在宮頸病變過程中是否起到啟動或推動作用，尚需更深入的研究加以驗證。

綜上所述，HSV-2出現在宮頸病灶中是低概率事件，不是宮頸癌致病的主要因素，但由于該病毒的致病特點，宮頸病灶HSV-2的持續存在極有可能在宮頸癌演變中起到重要作用，因此，臨床上不應忽視對HSV-2感染的宮頸病變患者的診治。

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Herpes simplex virus-2(HSV-2)infection in cervical lesions and the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.

LI Cheng-de,LI Ling,OU Li-hong,LEI Wei-hua,CHENG Zhuo-mei,DENG Chao-hua,LI Hai-zhu,MO Yan-fang.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Zhaoqing, Zhaoqing 526020,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe HSV-2 infection status in cervical lesions，and explore the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.MethodsCervical lesions and cervical secretions were collected from 101 patients with cervical lesion,HSV-2 DNA(real time PCR method)and human papilloma virus(HPV) genotype(flow-through hybridization)were detected.ResultsThe positive rate of HSV-2 DNA in cervical lesions was 10.89%,and that in cancer group and control group was 17.39%and 5.45%,respectively,with no significant difference between the two groups.The positive rate of HPV test in cervical lesions was 67.33%,and 13 subtypes of HPV were found in cervical lesions.The positive rate of the most common subtype of type 16 was 45.45%,and that in cancer group and control group was 97.83%and 41.82%,respectively,with the statistically significant difference between the two groups.(χ2=34.087,P＜0.001).The positive rate of HSV-2 merged with HPV was 9.90%.The positive rate of HPV in cancer group of HSV-2 infection was 100%.mixed infections of HPV16 subtype accounted for 75%. ConclusionHSV-2 is more common in co-infected with HPV16 subtype in patients with cervical cancer,and the potential impact of HSV-2 on cervical evolution should not be ignored.

Cervical cancer;Herpes simplex virus-2(HSV-2);Cervical tissue;Human papilloma virus(HPV)

R737.33

A

1003—6350（2014）16—2395—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0934

2014-02-22)

廣東省肇慶市科技創新計劃項目(編號：2011E181)

李成德。E-mail：lcd11@126.com