骨關節炎軟骨細胞中骨橋蛋白的表達調控研究

胡小東，馬信文

（攀枝花市第二人民醫院骨科，四川 攀枝花 617028）

·論著·

骨關節炎軟骨細胞中骨橋蛋白的表達調控研究

胡小東，馬信文

（攀枝花市第二人民醫院骨科，四川 攀枝花 617028）

目的檢測骨關節炎(OA)患者骨橋蛋白(OPN)的表達，探討Wnt/β-catenin信號通路對OPN的表達調控作用。方法分離OA患者(骨關節炎組12例)的軟骨細胞，并取非OA患者軟骨細胞作為正常對照(8例)，熒光定量PCR檢測OPN基因的表達；基因轉染雙鏈siRNA干擾β-catenin基因的表達；Western blot實驗檢測β-catenin和OPN蛋白的表達改變。結果骨關節炎組和正常對照組軟骨細胞OPN的mRNA表達量分別為(0.642±0.155)和(0.226±0.077)，兩組比較差異有統計學意義(t=6.74，P＜0.01)。特異性靶向雙鏈siRNA可以下調β-catenin的表達，Western blot檢測顯示下調β-catenin蛋白的表達后軟骨細胞OPN蛋白的表達也出現了相應的下調。結論骨關節炎患者中存在骨橋蛋白的表達上調，骨橋蛋白的上調受到Wnt/β-catenin通路的調控。

骨關節炎；骨橋蛋白；Wnt/β-catenin信號通路

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)又稱退化性關節炎、退行性關節病或骨關節病，是一組關節軟骨或軟骨下降解的機械異常性疾病，骨關節炎是一個常見的老年性骨科慢性疾病。80%的65歲以上的老人都會有骨關節的影像學改變，大約60%的老人會有臨床癥狀，流行病學統計顯示近年來骨關節炎的發病有逐年增加的趨勢[1-2]。骨關節炎的發病機制十分復雜，目前仍不清楚，最近的研究顯示骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)在關節軟骨的退行性變中發揮著關鍵的調節作用，可以誘發OA的發生[3-4]。本研究觀察了骨關節炎患者骨橋蛋白表達的異常，并探討了Wnt/β-catenin信號通路對OPN的表達調控作用。

1 資料與方法

1.1 病例選擇選取2012-2013年人工關節置換術的OA患者12例，其中男性4例，女性8例，年齡56～71歲，平均(61.5±9.4)歲，骨關節炎診斷標準參照中華醫學會骨科學分會修定的《骨關節炎診治指南》[5]，術中在軟骨退變區削取軟骨標本。另取本院因外傷手術時的游離軟骨8例作為正常對照，排除骨性關節炎患者。其中男性3例，女性5例，年齡51～72歲，平均(63.4±9.2)歲，兩組樣本在性別、年齡等一般臨床資料方面比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑DMEM培養基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol、RT-PCR試劑盒、SYBR Green熒光定量檢測試劑盒購自美國基因公司，β-連環蛋白(β-catenin)siRNA干擾試劑盒購自上海吉瑪生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶β-catenin、OPN、內參和二抗為美國R.D公司產品。

1.3 單細胞的制備和培養按照Matsui等[6]的方法分離軟骨細胞，簡述如下：分離的軟骨剪碎，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶37℃，水浴消化6～8 h，吹打細胞制備單細胞懸液，軟骨細胞放置于細胞培養箱培養于DMEM培養液中。采用RT-PCR方法檢測Ⅱ型膠原mRNA的表達水平來鑒定軟骨細胞。

1.4 熒光定量PCR嚴格按照Trizol和RT-PCR試劑盒說明書操作提取分離的軟骨細胞RNA，并同時反轉錄合成cDNA第一鏈，按照熒光定量PCR檢測試劑盒說明書操作，PCR反應管加入上下游引物，OPN：上游：5'-CCTTCCAACGATCTCTTACTACTTGG-3'下游：5'-ACTGGAAGCAAGAGGGGATG-3'；β-actin：上游：5'-AGTGTGTGAAGAAGGGTCG-3'，下游：5'-GGCAGTGATGGCATGGAACATA-3'，儀器為美國ABI公司Prism7500熒光定量PCR儀，程序設定為：95℃1 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，35個循環。△Ct值=目的基因Ct值-內參基因Ct值，目的基因的表達量采用2-△Ct評估。

1.5 基因沉默分離的OA患者軟骨細胞接種于6孔板，細胞達到60%～80%融合時，實驗分為對照(A)組、特異性RNA干擾(B)組、陰性RNA干擾對照(C)組，按照β-catenin RNA干擾試劑盒說明書使用Lipofectin 2000轉染小分子雙鏈RNA干擾序列。β-catenin干擾序列為5'-AGCGCUUGGAGCUCGAGAAdTdT-3'(正義鏈)，48 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測β-catenin基因沉默的效果。

1.6 Western blot1×SDS上樣緩沖液裂解上述處理的軟骨細胞，取50 μg蛋白SDS-PAGE膠電泳，蛋白電轉移至PVDF膜，按照抗體試劑盒說明書操作加入稀釋的特異性一抗孵育PVDF膜，4°C過夜，二抗室溫1 h，使用化學發光反應，暗室X-ray曝光，1 min后顯示目的條帶。

1.7 統計學方法應用SPSS16.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨關節炎患者軟骨細胞骨橋蛋白表達的改變骨關節炎組和正常對照組軟骨細胞骨橋蛋白的mRNA表達量(2-△Ct值)分別為(0.642±0.155)和0.226± 0.077，統計學分析顯示兩組之間差異具有統計學意義(t=6.74，P＜0.01)，見圖1。

圖1 骨橋蛋白mRNA表達的熒光定量PCR檢測

2.2 β-catenin siRNA對骨關節炎患者軟骨細胞骨橋蛋白表達的抑制作用從圖2可見特異性靶向雙鏈siRNA下調了β-catenin的表達，而陰性對照siRNA對β-catenin的表達水平沒有顯著的影響，說明本研究所用的雙鏈β-catenin siRNA能夠有效抑制β-catenin的表達。靶向β-catenin雙鏈siRNA干擾骨關節炎患者軟骨細胞48 h后，在下調β-catenin的同時也降低了軟骨細胞OPN蛋白的表達，說明β-catenin調控了OPN蛋白的表達，見圖2。

圖2 RNA干擾β-catenin后Western blot檢測β-catenin和OPN蛋白

3 討論

骨關節炎(OA)的發病率約占總人口的10%左右，一般隨著年齡的增長OA的患病率會逐漸增加。據世界衛生組織統計，50歲以上人群OA的發病率可達到50%，55歲以上發病率甚至可達到80%，軟骨細胞的代謝異常和退行性變是OA的主要病理改變[7]，但是其具體的發病機制目前仍不清楚，因此探討軟骨細胞退行性變的機制將會為OA的防治提供新的靶點和理論依據。

骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種多功能的磷酸化糖蛋白，通過與單核細胞和內皮細胞上的受體結合，調節不同的生物學過程，例如免疫反應、血管生成、軟骨內化骨、細胞再生、骨質疏松病變的起始等。OPN可以通過增強IL-12和抑制IL-10活性調節Th1 T淋巴細胞的反應來參與炎癥反應，有研究顯示OPN是OA中最早出現也是最主要的病理改變，OPN可以通過上調MMP-13和減少組織中的蛋白多糖致軟骨的退行性變，還可以誘導軟骨細胞的凋亡破壞關節軟骨[8-9]，本研究的結果也顯示了OA患者軟骨細胞中OPN的表達顯著高于正常對照。

β-連環蛋白(β-catenin)蛋白是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，Wnt/β-catenin通路激活時可使β-catenin蛋白游離出來計入細胞核發揮轉錄因子的作用調控下游靶基因的表達。已有研究顯示Wnt/β-catenin通路在保持關節完整性方面起著重要作用，例如在β-catenin轉基因的小鼠中可發現關節骨贅的形成，同時軟骨下有新的編織骨和關節軟骨全層缺失[10-11]。本研究使用靶向β-catenin的siRNA沉默β-catenin基因的表達后發現OPN蛋白也出現相應的降低，提示了β-catenin對OPN具有一定的調控作用，可能的機制是激活的β-catenin入核結合到OPN啟動子的上游調控元件增強了OPN的表達。

總之，本研究顯示骨關節炎患者中出現了骨橋蛋白的表達上調，骨橋蛋白的上調受到Wnt/β-catenin通路的調控。

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Regulation mechanism of osteopontin expression in osteoarthritis.

HU Xiao-dong,MA Xin-wen.Department of Orthopedics,the Second People's Hospital of Panzhihua City,Panzhihua 617028,Sichuan,CHINA.

ObjectiveTo detect the expression of osteopontin(OPN)in osteoarthritis(OA)patients,and explore the regulation mechanism of OPN by Wnt/β-catenin signaling pathway.MethodsThe chondrocytes were separated from OA patients(12 cases as OA group)and non-OA patients(8 cases as control group).The mRNA expression of OPN was determined by real-time PCR analysis.The small interfering RNA was used to specifically knockdown β-catenin in chondrocytes.And then the expression of β-catenin and OPN protein were detected by Western blot.ResultsThe 2-△Ctvalues of OPN mRNA were(0.226±0.077)and(0.642±0.155)in control and OA group,respectively.There was significant difference between the two groups(t=6.74，P＜0.01).The expression of β-catenin was significantly and specifically down-regulated by siRNA duplexes and a corresponding down-regulation was also detected in OPN protein expression by Western blot.ConclusionThere is an up-regulated expression of OPN in osteoarthritis patients,which is mediated by Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis(OA);Osteopontin(OPN);Wnt/β-catenin pathway

R684.3

A

1003—6350（2014）13—1877—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0730

2013-12-25)

胡小東。E-mail：hdxong@163.com