藥品微生物限度檢查用培養基儲存期限的探討

陳曉燕

（浙江省玉環縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 玉環 317605）

藥品微生物限度檢查用培養基儲存期限的探討

陳曉燕

（浙江省玉環縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 玉環 317605）

目的 對藥品微生物限度檢查用培養基的儲存期限問題進行研究，通過實驗確定最優存儲方法和時限。方法 分別將現配培養基為對照與2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培養基進行微生物限度適用性檢查，用標準菌株在各培養基中生長情況通過回收率及指示能力確定在此環境中保存配制好經滅菌的培養基的適用性符合藥典相關規定。結果 各標準菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培養基在促生長能力檢查時的回收率均＞70%，及各培養基對相應試驗菌的指示能力均符合規定。結論 配制好經滅菌的培養基在2～8 ℃避光冷藏60 d可以達到要求。

藥品微生物限度檢查；培養基；保存；回收率

2010版《藥典》附錄ⅩⅢ C微生物限度檢查法未對適用培養基的儲存條件及期限進行規定。為保證實驗質量，本文通過實驗研究對配制好用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口經滅菌的培養基在溫度為2～8 ℃避光儲藏，分別于15、30、60 d進行適用性檢查，已確保微生物限度檢查結果的可靠。

1 材料設備

1.1 儀器設備：恒溫干燥箱；凈化工作臺；生化培養箱；立式壓力蒸汽滅菌器；霉菌培養箱。

1.2 菌種：大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］；黑曲霉菌［CMCC（F）98003］。以上均從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購得的冷凍干燥菌種，按規定復蘇、傳代、保藏和使用，試驗用菌株的傳代次數均未超過5代。

1.3 培養基：營養瓊脂培養基；玫瑰紅鈉瓊脂培養基；甘露醇氯化鈉瓊脂培養基；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基；麥康凱培養基。以上培養基均由環凱生物制品有限公司購進，均在有效期內按成品培養基說明配置使用。

2 方法和結果

2.1 實驗環境

在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣超凈臺中操作。

2.2 菌液制備

2.2.1 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，33 ℃培養24 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，室溫放置下2 h內使用。

2.2.2 接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，27 ℃培養48 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，室溫放置下2 h內使用。

2.2.3 接種黑曲霉菌新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，27 ℃培養7 d，加入5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用開口帶有薄的無菌棉花能過濾菌絲的無菌毛細吸管，吸出孢子懸液質無菌試管內，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，2～8 ℃放置下，24 h內使用。

2.3 培養基配置

取各類培養基按要求用500 mL三角燒瓶各配制200 mL，用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口滅菌備用作為對照培養基。另取上述培養基按要求用500 mL三角燒瓶各配制200 mL，用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口后置于2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d。

2.4 試驗方法和結果

分別將現配對照培養基與2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培養基進行適用性檢查（促生長能力和抑制能力；指示能力），每個培養基進行3次獨立的平行實驗，所得菌落數為3次獨立平行實驗的平均數。

2.4.1 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌混懸液各2 mL分別放于6個平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，同時做空白對照，置30～35 ℃培養48 h，計數。結果見表1。

表1 營養瓊脂培養基適用性檢查

2.4.2 取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液-各2 mL分別放入4個平皿中每種菌懸液各2皿，每皿各1 mL），加入玫瑰紅鈉瓊脂培養基各20 mL，混勻，同時做一空白試驗。27 ℃培養72 h，計數。結果見表2。

表2 玫瑰紅鈉瓊脂培養基適用性檢查

2.4.3 取乙型副傷寒沙門菌的菌懸液各0.2 mL，分別涂布接種與2個已預培養8 h后并無菌生長的麥康凱瓊脂培養基中，混勻。同時，做一空白試驗。33 ℃培養18 h，計數（空白試驗培養48 h觀察結果）。結果見表3。

表3 麥康凱瓊脂培養基適用性檢查

2.4.4 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液各0.2 mL，分別涂布接種與已預培養8 h后并無菌生長的甘露醇氯化鈉瓊脂培養基各2皿中，混勻。同時，做一空白試驗。33 ℃培養24 h，計數（空白試驗和接種大腸埃希菌平皿的試驗培養72 h觀察結果）。結果見表4。

表4 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基適用性檢查

2.4.5 取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的菌懸液各0.3 mL，分別涂布接種與已預培養8 h后并無菌生長的十六烷基三甲胺瓊脂培養基各3皿中，混勻。同時，做一空白試驗35 ℃培養18 h，計數（空白試驗和接種大腸埃希菌平皿的試驗培養72 h觀察結果）。結果見表5。

表5 十六烷基三甲胺瓊脂培養基適用性檢查

2.4.6 指示能力試驗：取試驗菌0.1 mL，分別涂布于被檢培養基和對照培養基上，在相應的控制菌檢查規定的培養溫度和時間下培養，結果被檢培養基上試驗菌的菌落形態，菌落顏色及指示反應情況與對照培養基一致。各試驗菌在相應的培養基上的形態，顏色均與在對照培養基上抑制。

3 結 論

在《食品微生物學檢驗 培養基和試劑質量要求》通常建議實驗室自制培養基在保證其成分不會改變條件下保存，即避光、干燥保存，必要時在（5±3） ℃冰箱中保存，瓶裝及試管裝培養基不超過3～6個月[5]。而《藥典》附錄XⅢ2010版對微生物限度檢查的瓶裝培養基未明確進行規定和建議。本文通過實驗表明，接種大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培養基在促生長能力檢查時的回收率均＞70%，及各培養基對相應試驗菌的指示能力均符合規定，空白對照無菌生長?？芍?，本實驗室配制經滅菌后培養基的儲存時限可采用在2～8 ℃冷藏保存期限為60 d，其結果符合藥典相關規定。日常工作中保證了微生物限度檢查結果的可靠、有效。

[1] 國家藥典委員會中華人民共和國藥典.附錄XⅢ[M].北京:化學工業出版社,2010.

[2] 中國藥品生物制品檢定所中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[3] 蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社, 2007.

[4] 藥品GMP指南[M].北京:.中國醫藥科技出版社,2010.

[5] GB.4789.28-2013.食品安全國家標準、微生物學檢驗、培養基和試劑的質量要求[S].北京:中國標準出版社,2013.

R446.5

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1671-8194（2014）19-0111-02