同位素標記相對和絕對定量蛋白組技術研究進展

孔漢金，張克山，劉永杰，尚佑軍，吳斌，劉湘濤

1.中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州730046；2.華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，動物醫學院，湖北 武漢 430070

蛋白質組學是一種新興的高通量分析技術，與基因組學方法相結合，不僅能深入分析單個蛋白，還能對總體蛋白表達譜進行分析，能在總體層面上闡釋蛋白-蛋白相互作用以及細胞生物學事件，有助于發現各細胞因子之間全新的聯系。隨著蛋白質組學研究的深入，人們已不再滿足對生物個體組織細胞蛋白質組進行定性研究，而是著眼于蛋白質量的研究。定量蛋白質組學就是把一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜的混合體系中所有的蛋白質進行精確的定量和鑒定，在比較蛋白質組學研究中扮演重要角色。通過比較正常與異常細胞或組織中蛋白質表達水平的差異，找到與疾病密切相關的差異蛋白，進而確定靶分子，為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發、新陳代謝研究等提供理論依據。但這些蛋白很少處于有或沒有的狀態，而是更多地呈現不同豐度的水平，因此必須采用一種無偏見的策略，以一種敏感和準確的方法衡量這些蛋白的變化。鳥槍法蛋白組學策略能夠有效鑒定不同細胞和組織特定狀態下上調和下調的蛋白。基于穩定同位素標簽和液相色譜與串聯質譜，最早由Gygi[1]等提出的同位素親和標記（isotope-codedaffinity tags，ICAT）技術，其最大的缺點是蛋白質序列中必須含有半胱氨酸，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白質將會被遺失。美國應用生物系統公司（Applied Bio?systems Incorporation，ABI）研發的功能強大的同位素標記相對和絕對定量技術（isobaric tags for rela?tive and absolute quantification，iTRAQ）能在同一實驗中同時對8種不同樣品進行定性和定量分析，具有很好的精確性和重復性，并且彌補了ICAT技術的不足，迅速被廣大學者接受。我們簡要綜述iTRAQ在定量蛋白組史中的地位作用、研究策略，及其在病毒致病機制研究和醫藥臨床相關問題中的應用。

1 定量蛋白組學的研究歷史

過去20年，大量基因組數據信息的出現徹底改變了利用化學方法鑒定單個蛋白的方式。蛋白數據庫中覆蓋眾多蛋白，并且增加了注釋部分，使蛋白信息更詳細。但是數據庫中的蛋白信息只能用于定性鑒定，目前還不可能僅根據數據庫中的參比蛋白對攝動系統內蛋白表達水平進行差異比較，不過結合膠染色和蛋白標簽技術去探知不同系統中蛋白表達的平行比較還是可能的。

傳統雙向電泳通過凝膠分離和質譜鑒定差異表達蛋白存在許多局限性，如不能檢測具有極端等電點的、分子過大或過小的、低豐度的蛋白及膜蛋白，而且膠依賴技術的重現性較低，意味著定量困難和不準確。涉及同位素標簽的鳥槍法蛋白組技術克服了傳統雙向電泳策略定量的諸多問題[2]。細胞培養條件下穩定同位素標記技術（stable isotope label?ing with amino acids in cell culture，SILAC）采用含有輕、重同位素型必需氨基酸的培養基進行細胞培養，使胞內蛋白被同位素穩定標記，將蛋白質等量混合后進行分離和質譜鑒定，氨基酸代謝滲入蛋白中，導致相應肽的質量偏移和質譜峰值強度改變，從而顯示蛋白的相對豐度，對不同樣品間的相同蛋白做出相對定量，屬于體內代謝標記法[3]。盡管SILAC是一種高通量、高靈敏度、標記效果穩定的技術，但其主要缺陷在于必須依賴細胞系的內源標簽，因而只能用于活體培養的細胞或低等有機體（如蠕蟲），對于疾病研究中常用的組織樣品、體液樣品等無法分析。同位素親和標簽技術（isotope affinity coded tag，ICAT）是一種能比較2個不同樣品中含半胱氨酸殘基的特異性蛋白的標簽策略[1]。2組樣品分別通過重鏈和輕鏈標記后混合，經液相色譜分離質譜鑒定差異表達蛋白。ICAT標記的肽段信號強度定量著2種樣品中同一蛋白的相對豐度。ICAT技術減少了樣品的復雜性，但其對半胱氨酸殘基的特異性意味著不含半胱氨酸的肽段將不被標記，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白將會被遺失。為了克服ICAT技術的主要局限，ABI公司開發了iTRAQ技術，這是一種新的、功能強大的進行絕對和相對定量研究的方法[4]。該技術起初的設計可同時對4組樣品進行分析，現已發展到8組樣品[5]。iTRAQ試劑為肽段N端及賴氨酸側鏈氨基標記同重元素，標記后的不同樣本間的同一蛋白表現為相同的質荷比，意味著不同樣品的同一肽段在一級質譜中表現為同一信號峰，減少了樣品分析的復雜性。而在二級質譜中，肽段丟失平衡基團后信號離子表現為不同質荷比的峰，根據波峰的高度及面積可以定量不同樣品間的同一蛋白。

2 iTRAQ試劑結構

iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括報告基團、肽反應基團和平衡基團，組合成相對分子質量為145的基團（圖1）。iTRAQ試劑通過肽反應基團與肽段N端和賴氨酸側鏈上的氨基結合，幾乎可以標記樣本中的所有蛋白。標記肽段經MS/MS打碎后，報告基團脫落產生不同質荷比（114、115、116、117、118、119、121和122）的診斷離子。診斷離子是iTRAQ技術蛋白質定量研究的關鍵，其峰高及面積與樣品中同一肽段的相對豐度呈正比。iTRAQ標記肽除了能產生用于肽段定量的診斷離子外，還產生強大的y-ion和b-ion離子信號用于蛋白鑒定。iTRAQ標簽設計中，選擇合適的報告基團可減少低質量區域如基質、碎片離子噪音的干擾。iTRAQ 8-plex試劑報告基團缺少120，因為苯丙氨酸質荷比為120，會對質譜鑒定結果有干擾。

3 iTRAQ的基本實驗流程

圖1 iTRAQ試劑結構圖[6]

iTRAQ實驗流程包括樣品還原、烷基化、半胱氨酸封閉和胰蛋白酶消化。消化后的肽段用4或8-plex iTRAQ試劑標記，然后混合到同一支試管內，經色譜純化后進行質譜檢測及分析。質譜分析中，不同樣品來源的相同肽段以單一峰出現（iTRAQ平衡基團確保所有標記呈現相同的質荷比）。在二級串聯質譜，iTRAQ報告基團脫落，其相對強度用于定量。每個四肽段以相同方式產生b-ion和y-ion離子用于蛋白鑒定。一般情況下iTRAQ并不需要在酶解前分離蛋白，但為了檢測低豐度蛋白，可提前對樣品進行分離，富集感興趣的蛋白組分。經一維液相分離的肽段上質譜鑒定會存在高豐度肽段掩蓋低豐度蛋白的檢測，目前往往偶合多維分離蛋白鑒定技術（MudPIT）[7]，包括親和層析、離子交換層析、反向色譜層析和凝膠排阻層析。質譜檢測后的數據經由生物信息學元件分析用于蛋白定量和鑒定。已經開發了多種功能強大的用于iTRAQ數據庫搜索和分析的生物信息學元件，其中MASCOT是目前應用最為廣泛的蛋白搜索引擎。這些生物信息軟件具有很多特性，包括排除二級質譜iTRAQ報告基團、肽段N端修飾、賴氨酸修飾、半胱氨酸殘基的甲基硫甲磺酸酯（MMTS）修飾的光譜鑒定及校正iTRAQ報告基團的肽譜峰值。而且這些生物信息分析軟件也可自動完成相對定量。GPS Explorer（AB Sciex）能夠定量數據庫中所有肽段的iTRAQ蛋白和肽段比值。選擇一個標簽作為基準質量，比值通過片段校正面積/參考校正面積得到。計算過程中常常用到的歸一化因子能夠規范不同樣品因含不平等總蛋白導致的iTRAQ比值異常。

4 iTRAQ實驗設備和定量的準確性

iTRAQ技術中兩大最普遍的質譜儀分別為MALDI-TOF-MS/MS和ESI-TOF-MS/MS，兩者在不同iTRAQ分析中的準確性和性能各有所長。Kuzyk和Scheri對確定濃度的6種蛋白混合物的分析表明MALDI-TOF-MS/MS的鑒定結果更可靠，而在分析復雜的生物樣品時MALDI-TOF-MS/MS與ESITOF-MS/MS相差不多[8-9]。經液相色譜分離的肽段MALDI-TOF-MS/MS通常比ESI-TOF-MS/MS更常用。傳統iTRAQ不能聯用含離子阱的質譜儀如LTQ-Orbitrap進行蛋白定量，這是由于在標準的MS/MS碎片離子碰撞誘導解離（CID）下，質譜儀中的離子阱不能識別低分子量閾值的小產物離子。有人利用LTQ-Orbitrap質譜儀，通過改進脈沖解離（PQD）和高能碰撞誘導解離（HCD）片段方法，與CID聯合，使iTRAQ全蛋白組定量更敏感更準確[10]。iTRAQ分析結果經生化檢測方法如定量Western印跡和免疫熒光顯微技術驗證有著很高的相關性，但提供合適的iTRAQ數據統計分析也是必要的[11]。無論使用什么質譜儀，低信號數據都有相對較高的變異性[12]。低豐度蛋白常以小肽段形式檢測，但當使用基于統計的濾波方法時，小肽段會被數據庫漏掉。許多生物模型有助于解決這些問題，包括峰值強度的加乘誤差模型和IsobariQ元件采用的方差穩定規范化（VSN）算法[13]。同位素污染和背景干擾常會引起iTRAQ值的一系列低估。利用數據處理軟件校正化學濃縮和iTRAQ試劑中天然同位素雜質，從而可提供相對準確的同位素標記。在前體離子選擇期間，質譜儀不能識別相似質荷比的2個肽段，這些肽段產生的二級質譜光譜將會包含碎片離子和iTRAQ報告基團，通過高分辨率的樣品分離，可以緩解相似肽段之間的覆蓋[14]。

5 iTRAQ分析結果的校驗

iTRAQ能夠無偏見地定量和分析樣品蛋白組信息，其目的是為我們進一步研究提供線索，而不是提供最終結論。iTRAQ實驗產生大量數據，須提取有用信息并進一步驗證，驗證方法取決于實驗目的，但一些關鍵點應考慮。用cut-off值去除檢測低于確定數目和離子總量分數置信區間的肽段，可大大簡化數據分析（檢測低于95%總離子分數置信區間和小于2肽）。iTRAQ蛋白率是平均值，通過計算每個肽段的單個肽段率來鑒定蛋白。任何一個不準確的肽段率可能會改變整個蛋白的平均比值，因此須密切關注每個蛋白的單個肽段率。iTRAQ檢測的蛋白差異表達情況可通過生化方法進行驗證，如Western印跡、ELISA或免疫組化。當免疫學方法不可用時，基于多反應監測（MRM）的高通量質譜能有效用于驗證生物標記物[15]。

6 iTRAQ揭示病毒致病機制

基于質譜技術的定量或半定量蛋白組方法，已廣泛應用于病毒宿主相互作用的研究中，針對病毒感染的宿主研究闡釋了諸多病毒宿主相互作用的分子事件，為揭示病毒致病機制和診斷治療提供了重要線索。

Lu[16]等用iTRAQ技術比較了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染和非感染條件下，豬肺泡巨噬細胞（PAM）的蛋白表達情況，共鑒定到160個宿主蛋白在病毒感染后明顯改變，這些差異表達蛋白參與病毒結合、細胞結構、信號轉導、細胞黏附等多個生物過程，他們通過Western印跡對IFIT3、SOD2和hnRNP A1等3個蛋白的表達進行了驗證，發現hnRNP A1在PRRSV的宿主細胞內復制中扮演重要角色。Liu[17]等用相同方法比較了豬圓環病毒感染豬肺泡巨噬細胞的蛋白組學變化，共鑒定到145個宿主細胞蛋白發生了差異表達，這些差異表達蛋白對于闡明病毒復制和致病機制具有重要作用。Li[18]等對石斑魚虹彩病毒感染石斑魚胚胎細胞系做了iTRAQ分析，鑒定到49個病毒蛋白，其中11個是首次報道。另外還鑒定到743個宿主蛋白，這些蛋白可歸類到218個不同的蛋白分類中，其中分別有14個和5個宿主蛋白在病毒感染后出現表達上調和下調。α-2-巨球蛋白同型體1參與蛋白酶抑制，該蛋白在石斑魚虹彩病毒感染石斑魚胚胎細胞后表達上調，表明病毒可能通過抑制宿主蛋白酶和泛素表達而保護自身蛋白組分不被降解。iTRAQ技術分析結果為進一步研究和了解病毒宿主的相互作用、病毒感染的分子機制和發病機理提供了重要線索。

iTRAQ技術也可用于全病毒的組分分析。Li[19]等用iTRAQ技術聯合LC/MALDI-TOF MS/MS對對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）做了蛋白質組學分析，發現7個蛋白具有乙酰化的N端，RT-PCR確定了13個新鑒定的病毒蛋白。而且利用iTRAQ技術可區分WSSV病毒粒子膜蛋白與核衣殼蛋白，共鑒定到23個包膜蛋白和6個核衣殼蛋白，提示iTRAQ是一種能有效鑒定病毒蛋白亞細胞定位的方法。

7 iTRAQ在醫藥領域的應用

近年來iTRAQ技術在癌癥、神經退行性疾病、肝臟和腎臟問題、妊娠毒血癥、糖尿病、胰腺炎和自身免疫性疾病等醫療領域應用廣泛。通過研究發現疾病標記物，以便弄清疾病的發病機制，提供疾病早期診斷方法，鑒定潛在的治療靶點，以及弄清藥物的作用機制。還有研究試圖找到一些標記物用于預測癌癥病人預后[20-21]。

DeSouza等[22]利用iTRAQ試劑定量標記正常子宮和子宮癌組織，鑒定到9個潛在的生物標記物，后試圖采用40份臨床樣品驗證這一結果，最后發現用這9個標記物區別正常和癌癥病人時并不具備敏感性和特異性，但卻發現另外3個蛋白（丙酮酸激酶、伴侶蛋白10和α1-抗胰蛋白酶）有著很好的敏感性和特異性。Richard[23]等用iTRAQ試劑對白血病癌基因TEL/PDGFRβ轉染和未轉染的干細胞系（FD?CP2mix）裂解液進行標記，并用液相色譜進行檢測，根據報告離子的比值得到蛋白表達量的變化，并與用微陣列技術檢測的轉染和對照干細胞系結果進行對比，具有一致性，可能對癌基因作用機制研究有幫助。Glen等[24]利用iTRAQ鑒定到前列腺癌退化抗原gp96，一種對區分惡性和良性腫瘤有重要意義的標記物。Rudrabhatla[25]等利用iTRAQ技術發現神經微絲蛋白氨基酸殘基在Alzheimer病人中有著顯著的磷酸化。用iTRAQ也可以鑒定到膜蛋白，Han等[26]利用iTRAQ比較了常染色體顯性多囊腎病野生型和患病鼠模型的腎臟質膜，鑒定到潛在的治療靶標。Grant[27]等利用iTRAQ研究心臟左心室衰老后蛋白組變化，揭示隨著年齡的增長心臟失去舒張功能的機制。Pendyala[28]等利用iTRAQ研究HIV-1感染后出現的神經認知性障礙（HAND）的蛋白組學變化，發現維生素E結合蛋白Afamin表達下調。

利用iTRAQ比較正常與病理情況下蛋白組學變化，對于診斷疾病具有重要意義。但體內皮膚成纖維細胞、血清、唾液和其他組織常因病人年齡、性別和基因背景不同而出現變化，而不是由于基因突變或疾病本身狀態導致的特異性。例如，Miike[29]等利用iTRAQ技術展現了血清蛋白組分的性別差異；Truscott[30]等利用iTRAQ分析人類水晶體，表明隨著年齡差異，蛋白-膜的相互作用有顯著改變。在關于遺傳神經肌肉疾病的研究中，脊髓性肌萎縮（SMA）病人的GM03813皮膚成纖維細胞基因突變導致SMN蛋白大量減少。結合iTRAQ標簽技術和二維液相色譜及MALDI TOF/TOF質譜分析，比較SMA病人和正常人的成纖維細胞的定量蛋白質組變化，發現SMA病人和相同年齡的陰性組最大的差異是他們具備不同基因型。但是，存在于惟一原代細胞系的肌源細胞（GM03813）而不是其他因素導致成肌細胞特定蛋白如SMA細胞中的肌間線蛋白顯著增加。這些現象為我們獲得無成肌細胞的纖維細胞群體的無限增殖和克隆原代細胞系提供了線索[11]。

在體內進行藥物對病人影響的研究非常困難，面臨諸多問題，如組織樣品采集、飲食改變、感染和病人年齡等，但通過藥物和非藥物作用單細胞系的iTRAQ比較用于研究藥物作用和影響機制則直截了當。Wang[31]等利用iTRAQ技術研究β-受體阻滯藥卡維地洛對血管平滑肌細胞的影響，發現13個蛋白發生了差異表達。Bai等利用iTRAQ技術觀察抗凝結藥物華法林對HepG2細胞的影響，鑒定到2種蛋白DJ-1和14-3-3發生了明顯的差異表達。2-丙基戊酸鈉被用作抗驚厥和心境穩定劑，是一種脫乙酰化酶（HDAC）抑制劑，被認為是治療SMA的有效藥物，常見副作用是導致骨質疏松。為了探清藥物治療SMA出現的副作用情況，利用iTRAQ技術對藥物治療和無藥物治療的SMA皮膚成纖維細胞進行定量蛋白組學研究，結果發現治療組的膠原Ⅰ和Ⅵ、膠原結合糖蛋白、骨鈣化素顯著減少。膠原Ⅰ是骨基質的主要蛋白成分，骨粘連蛋白在骨形成中扮演重要角色，這些結果揭示了長期服用2-丙基戊酸鈉后導致出現骨質疏松的機制。

8 生物靶標

盡管已有很多文獻報道利用iTRAQ鑒定到潛在疾病標記物，但是只有很少的靶標得到充分驗證，可以作為臨床患者受益的靶標。為了讓一個新的生物標記物引入臨床實踐，必須提供充分的證據來證明該標記物是有效的、精確的和可重復的，并且它除了能夠有助于診斷病情或改善病情狀況，也應當有成本效益[32]。

9 結語

毋庸置疑，最近iTRAQ標簽技術對定量蛋白組學的發展有著重要的影響。在同一實驗中可分析8種樣品增加了實驗設計的靈活性，并且沒有復雜的質譜數據分析。新的生物標記的發現將幫助我們更好地弄清疾病致病機制和預后，用于提高早期診斷的敏感性，找到治療靶點，弄清藥物治療作用的機制。盡管iTRAQ在發現潛在生物標記物中有著重要作用，但將iTRAQ技術用于臨床實驗室的日常分析仍需要解決眾多問題。隨著影響iTRAQ定量準確性問題的解決和數據分析工具的改進，在未來幾年內醫學研究將從iTRAQ定量蛋白質組技術中得到巨大的幫助。

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