腺病毒55型抗原表位分析及評價

李鵬飛，陳堃，修冰水，張慶波，張賀秋

1.河北聯合大學，河北 唐山 063000；2.軍事醫學科學院 基礎醫學研究所，北京 100850

腺病毒（adenovirus，Ad）包括1～55血清型[1]，能引起急性腺病毒肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎和急性間質性腎炎等多種臨床癥狀[2]。我國常見的呼吸道傳播的腺病毒類型主要為3型、7型[3]。腺病毒可以引起呼吸道感染暴發，特別是生活在軍隊、學校等封閉環境內的人群[4-5]。2006年，陜西省岐山縣中學暴發急性呼吸道疾病疫情；2012年2月，河北保定解放軍252醫院發生聚集性疫情。經鑒定，這2起集中發熱事件均由腺病毒55型（Ad55）感染所致。Ad55是由Ad11與Ad14基因重組而形成的新型毒株[6]，其臨床表現新特征，如發熱38.5℃以上、流鼻涕、咽痛、咳嗽、伴有呼吸困難，可能更易于暴發流行，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感[7]，可引起公眾恐慌。由于缺少有效的針對腺病毒的治療手段和疫苗，因此針對呼吸道癥候群，研制包含Ad55在內的廣譜性腺病毒早期快速診斷試劑，對疾病預警、確定隔離人群，控制疾病傳播具有重要意義。

人腺病毒基因組長約36 kb，其衣殼呈規則的20面體結構，由六鄰體、五鄰體和纖突等蛋白組成復合結構[8-9]。六鄰體含有型、組和亞組抗原決定簇，是診斷不同血清型的標準[10]。六鄰體含有重要的中和性抗原表位，也是疫苗研究的重要靶點[11]。纖突有血清特異性，且含有體外血細胞凝集的種屬特異性抗原決定位點。有研究顯示，纖突抗體的產生略早于六鄰體[12]，因此，纖突抗原在早期診斷中具有重要地位。由于Ad55發現較晚，有關其抗原表位分析尚未見報道。我們用生物信息學技術預測了Ad55六鄰體和纖突抗原表位，為研制包括Ad55在內的腺病毒血清學檢測和疫苗提供免疫學基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

47份疑似腺病毒呼吸道感染臨床樣本血清由本室保存；48份正常人血清樣本來自北京血站紅十字血液中心；大腸桿菌HB101和表達載體pBVIL-1由本室保存；Taq DNA聚合酶為北京百泰克生物技術有限公司產品；T4DNA連接酶為TaKaRa公司產品；DNA限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ購自Pro?mega公司；配制LB培養基的胰蛋白胨及酵母提取物購自本院條件處；PCR產物回收試劑盒由北京百泰克生物技術有限公司生產。引物全部由上海英駿生物技術有限公司合成；DNA序列測定由中美泰和生物技術有限公司完成。

1.2 抗原表位分析

從 NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下載Ad55的氨基酸序列，運用Biosun生物軟件比對序列，分析六鄰體、纖突的抗原表位情況，確定克隆表達的表位區間。

1.3 引物設計與基因合成

根據抗原表位的氨基酸序列，采用大腸桿菌優勢密碼子設計并優化優勢抗原表位區間的基因（分段設計并合成引物，采用重疊延伸PCR方法合成各基因片段，并逐步將各片段搭橋擴增，最終得到完整的優勢抗原區間基因）。

1.4 原核表達載體的構建

設計含酶切位點的上下游引物，對上述基因進行PCR擴增，從而在基因片段兩端引入酶切位點，經雙酶切后插入經同樣酶切的表達載體pBVIL-1，轉化大腸桿菌HB101，挑選鑒定陽性克隆并測序。

1.5 抗原表達與純化

鑒定出的陽性克隆在37℃培養過夜后，轉至新鮮的LB培養基，37℃培養2～3 h，至D600nm值為0.4～0.6，42℃誘導表達4 h以上，離心收集菌體，用TE緩沖液沖洗菌體并懸起，超聲波破碎細胞，離心收集上清，用陰離子交換柱Sephrose 4B和分子篩Sephdex G50純化抗原，SDS-PAGE鑒定各步分離產物。

1.6 間接ELISA法評價Ad55主要抗原表位活性

以純化的Ad55主要抗原表位蛋白包被酶聯板，用間接ELISA法對疑似患者和正常人血清樣本進行測定，根據D450nm值計算S/c，評價重組抗原的反應活性。

2 結果

2.1 序列比對與抗原表位選擇

運用Biosun生物軟件預測Ad55六鄰體、纖突蛋白抗原表位，表位峰值較高的區段如圖1中橫線所示，Ad55六鄰體含有4個連續表位（130～190、180～240、230～280和270～322 aa，以下分別稱為表位1～表位4）和2個非連續表位（410～460和620～680 aa，以下分別稱為表位5、表位6），纖突含有2個主要抗原表位（135～165和210～260 aa，以下分別稱為表位7、表位8），作為克隆表達的目的序列。

2.2 抗原表達與純化

測序結果顯示基因插入正確。將測序正確的表達菌株進行大量誘導表達，超聲波裂解后的菌懸液幾乎無沉淀，經SDS-PAGE鑒定，8個融合Ad55蛋白為包涵體形式表達，純化后，其純度可達95%以上。

2.3 間接ELISA評價8個融合Ad55蛋白的抗原性

以純化的融合Ad55蛋白包被酶聯板，用間接ELISA初步檢測48例正常人和47例疑似患者的血清，ROC曲線分析結果見圖3。其中表位4、5和8的ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.76（P＜0.05）、0.77（P＜0.05）和0.81（P＜0.05），具有一定的診斷意義。

2.4 3種Ad55診斷抗原的變異分析

考慮到腺病毒具有多個血清型，我們對篩選的表位4、5和7等3個Ad55表位與其他血清型之間的變異情況進行了比較，主要篩選了臨床具有呼吸道癥狀，且在我國有流行傳播的3、7、11和14共4種血清型，結果見表1。篩選的Ad55表位與不同腺病毒血清型之間的序列同源性并不相同，3個Ad55表位均與Ad11相關表位之間的同源性最高，與Ad3的同源性最低，提示3個表位除了可檢出Ad55外，對Ad11也有相同的檢出能力。表位7除了與Ad3差異較大外，與Ad7、Ad11、Ad14其他型別之間具有較高的同源性；表位5除了與Ad11高度同源外，與Ad3、Ad7、Ad11存在較大差異，是最有可能具有Ad55血清學特異性的抗原。這一結果提示，可通過一定的抗原組合達到針對多種腺病毒血清型的檢測目的。

圖1 Ad55六鄰體（A）和纖突（B）的抗原表位分析

3 討論

腺病毒在我國上世紀50～60年代出現過大規模流行，其中兒童感染肺炎死亡率高達30%[13]。沉寂了半個世紀后，近些年國內又暴發了多起腺病毒感染造成的集體發熱疫情。由于腺病毒引發的肺炎癥狀并不典型，且對抗生素不敏感，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感等，給公眾造成一定的恐慌，因此，對腺病毒的早期診斷具有重要意義。

圖2 8種Ad55表位抗原的純化M：蛋白marker；1～8：依次為表位1～8

圖3 8種Ad55表位抗原檢測的ROC曲線

表1 Ad55篩選表位氨基酸序列的同源性分析

目前針對腺病毒的檢測主要是基因檢測，具有靈敏度高、能分型等特點[14]，但操作復雜，儀器昂貴，無法用于基層。20世紀60年代臨床建立的以免疫熒光為主的腺病毒抗原檢測，主要針對3型和7型,往往難以檢測新的腺病毒血清型[15]。本研究針對新發腺病毒55開展相關抗原研究，為研發廣譜性腺病毒免疫學檢測技術打下基礎。

Ad55是由腺病毒11型與14型基因重組形成的新型毒株[3]，是新發傳染病原。我們初步用疑似腺病毒感染者血清篩選出3個Ad55抗原表位，序列比較結果提示Ad55抗原與Ad11高度同源，與Ad3、Ad7的同源性較差。因此，針對Ad3、Ad7的單抗無法識別新發的Ad55表位，是造成Ad55漏檢的主要原因。本研究獲得的3個表位，特別是135～165 aa表位，與除Ad3型外所有的腺病毒血清型高度同源。因此，補充Ad3型相關表位，聯合本研究篩選的表位，能提高檢測腺病毒血清型的覆蓋面，最終為研制包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad55在內的我國通用性呼吸道癥狀腺病毒的免疫檢測奠定基礎。

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