結核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的提純及活性初步鑒定

戴振華，郭蘭芹，馮曉燕，張立，郄霜,4，楊錫琴，修冰水，陳堃，彭瑞云，張賀秋

1.軍事醫學科學院 a.基礎醫學研究所；b.放射與輻射醫學研究所；北京 100850；

2.華北石油總醫院，河北 任丘 062552；3.天津海河醫院，天津 300350；4.河北聯合大學，河北 唐山 063000

結核病（tuberculosis，TB）是一種古老的疾病，自上世紀90年代，本已得到控制的肺結核又在世界范圍內廣泛流行，每年超過200萬人死于TB[1]。2009年,世界衛生組織發布報告，2008年中國TB發病人數為100萬～160萬，僅次于印度，居世界第2位。這表明TB的預防和控制在我國尤為重要。

脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是分枝桿菌細胞壁的重要組成部分，包含9個單克隆抗體結合表位，屬結核分枝桿菌特異性抗原，具有較強的免疫原性和免疫調節功能，可刺激機體產生相應的抗體[2]，因而是結核病血清學診斷中應用較廣的抗原。

我們參照有關文獻[3]，初步建立了從結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）中提取和純化LAM的方法，并采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測結核患者血清中的抗LAM抗體，取得了較為滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 血清標本

64例肺結核病患者來自天津海河醫院，全部為連續納入的臨床新近診斷的活動性肺結核患者，未合并感染HIV，未接受抗結核治療或治療時間不超過2周。67份健康對照血清樣本來自健康獻血員，無臨床癥狀，未感染其他疾病。

1.2 材料

MTB標準菌株H37RV由本室保存；改良羅氏培養基購自貝索公司；羊抗兔IgG-HRP購自中杉金橋公司；兔抗LAM購自Mossman Associates Inc公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；硝酸纖維素膜為Pall公司產品；甲醇、氯仿、苯酚、95%乙醇、硫酸均為國產分析純產品；離心機為Sigma公司產品；細胞粉碎機為寧波新芝超聲設備有限公司產品；紫外分光光度計為UNICO公司產品；凝膠成像儀為Bio-Rad公司產品。

1.3 LAM抗原的提純

將MTB H37RV接種在羅氏雞蛋培養基上，37℃培養3～4周，收取菌落，100℃滅活2 h，用蒸餾水和PBS（pH7.4）各洗滌1次，再用氯仿∶甲醇（2∶1）混合液脫脂3次，去除菌體中的培養基成分，用PBS（pH7.4）懸浮，冰浴超聲破碎（超聲30 s，停30 s，共10 min），8000 r/min離心取上清，加入40%的苯酚萃取（70℃ 1 h），4℃、8000 r/min離心取上清，用蒸餾水透析2 d，用2倍體積的95%乙醇沉淀，LAM存在于上清液中，分裝，凍干。

1.4 LAM的鑒定

將提純的LAM進行SDS-PAGE，分別用考馬斯亮藍染色和Western印跡鑒定；將LAM轉印至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；以兔抗LAM為一抗，4℃孵育過夜；用TBST洗膜3次，每次5 min；用羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h；用TBST洗膜3次，每次5 min；用TBS洗膜1次，5 min；加化學發光液，于成像儀中照像。

1.5 LAM的含量測定

采用苯酚-硫酸法檢測糖含量。以雙蒸水為空白對照，以L-阿拉伯糖為糖標準，分別配制1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL 的標準糖溶液；取雙蒸水200 mL、樣品200 mL、糖標準液200 mL，各加入濃硫酸1 mL、9%苯酚200 μL，搖勻后置暗處30 min；測定D485nm值，空白調零后，以糖濃度為橫坐標、D485nm值為縱坐標，制作濃度范圍0.1～1 mg/mL的標準曲線，直線回歸計算樣品中的糖含量。

1.6 ELISA法檢測血清中的抗LAM抗體

用純化的LAM包被酶聯測定板，包被液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋，每孔0.125 mg抗原包被96孔酶聯板，4℃過夜，洗板2次，每次1 min；用1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸鹽緩沖液（pH7.4）室溫封閉4 h，拍干；新鮮血清樣本用稀釋液按1∶10稀釋后加入96孔酶聯板，37℃孵育30 min，洗板5次，每次1 min；分別加入抗人IgG酶結合物，37℃孵育20 min，洗板5次，每次1 min；將顯色液A和B按照1∶1的比例混合后加入各孔，37℃孵育10 min，加入終止液終止顯色，在酶標儀上檢測樣本的D450nm值。

1.7 統計學方法

應用GraphPad Prism 4對數據進行統計學分析。數據符合正態分布，采用t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAM鑒定結果

樣品經SDS-PAGE，凝膠用考馬斯亮藍染色，未見明顯條帶，說明提純得到的樣品基本不含蛋白質；經Western印跡分析（圖1），LAM遷移范圍相對分子質量為25×103～40×103，主要集中在35×103處。

2.2 LAM含量測定結果

1.13 g濕重菌體經超聲離心后去除沉淀0.86 g，得到粗制細胞壁0.27 g，提純得到LAM共4 mL，經苯酚-硫酸法測定，樣品中的糖含量為3 mg/mL。最終提取得到12 mg LAM，LAM總收率約10.6 mg/g濕菌體。

2.3 血清標本ELISA檢測結果

以純化的LAM為抗原，通過ELISA方法檢測64例結核病患者、67例健康體檢者的血清，結果見表1。LAM抗體在結核組明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義（t=8.668，P＜0.001）。以D450nm值≥健康體檢組的 D450nm均值+2s（cut-off值=0.2045）為陽性，檢測的敏感性為67.19%（43/64，95%CI：54.31%～78.41%），特異性為95.52%（64/67，95%CI：87.47%～99.07%）（圖2）。圖3為抗LAM抗體檢測的ROC曲線（曲線下面積=0.9228，面積越接近1說明檢測的性能越好）。

3 討論

細菌細胞表面的成分通常被視為尋找新的疫苗和診斷的重要靶標。LAM是構成結核分枝桿菌細胞壁的重要糖脂，占細菌總重量可能高達15 mg/g，其特征最早在1980年確定[4]。LAM由甘露聚糖主鏈組成，連接含有糖精側鏈的寡阿拉伯糖，前者連接到磷脂酰肌醇的脂質錨定基團[5]。已報道LAM在感染的宿主中對免疫系統影響廣泛，從結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌中分離得到的LAM可引起T細胞增殖的抑制[6]，干擾γ-干擾素介導的巨噬細胞的活化，清除毒性氧自由基，抑制蛋白激酶活性[7]，合成mRNA編碼的白細胞介素-2、-5，及刺激人T-細胞中的粒細胞/巨噬細胞形成集落刺激因子[8]，促進單核細胞產生腫瘤壞死因子[9]，活化和調解補體[10]。這些發現表明，LAM很可能在結核病及其他分枝桿菌感染疾病的發病機理中起很大作用。

表1 抗LAM抗體血清檢測結果（n）

圖1 LAM的Western印跡1：預染marker；2：提純的LAM

圖2 抗LAM抗體血清檢測結果的散點圖

圖3 抗LAM抗體血清檢測形成的ROC曲線

在細胞表面，LAM作為一種免疫調節劑可以很容易地與宿主受體進行相互作用[11]。LAM具有高免疫原性，在分枝桿菌感染過程中產生抗LAM抗體[2]，在血清中很容易檢測到抗LAM抗體[12]，檢測抗LAM抗體已用于診斷活動性肺結核[12-13]。在循環抗原-抗體免疫復合物中會發現LAM抗原和抗LAM抗體聚集[13]。國內在此方面的研究較少，而且沒有相關試劑盒，而進口試劑相對較貴，限制了我國以LAM為靶標的針對結核病的檢測。我們旨在尋找一種簡單的LAM純化方法，將純化得到的LAM用于結核病的血清學檢測，使LAM抗體檢測試劑能國產化，并為今后以LAM為基礎的研究提供材料來源，制備相應抗體，對診斷和檢測MTB的感染，篩選抗結核藥物及預測抗結核治療的預后具有一定的價值。

關于LAM的純化，有離子交換、凝膠過濾色譜法的組合[4]，疏水性相互作用色譜法[14]及Sephacryl S-100凝膠柱層析法[15]，但都比較繁瑣。我們在Wu[3]方法的基礎上略做改動，添加了脫脂去除培養基成分，再通過苯酚萃取、乙醇沉淀，得到LAM，取得較理想的濃度和純度。此法總的處理時間只需要3 d，操作簡單，得率高。LAM是由多種成分組成的異質體，不同異質體由不同的糖基化和酸基化程度決定，用此法得到的LAM能覆蓋不同大小的LAM。

利用純化得到的LAM，通過ELISA方法初步檢測64例結核病患者、67例健康體檢者血清，檢測敏感性為67.19%，特異性為95.52%。Sada[16]等研究表明，在痰涂片培養陽性的活動性肺結核患者中檢測的敏感性為88%，在痰抗酸染色陰性的活動性肺結核患者中檢測的敏感性為67%，在合并HIV感染的肺結核患者中檢測的敏感性為57%，特異性均為100%。敏感性和特異性的差異可能與抗原濃度、包被濃度、血清稀釋度、酶標抗體的效價，以及顯色系統都有一定的關系；本次檢測的樣品數量較少、樣品未分組也是差異形成的原因，仍需要擴大樣本量來進一步確定此LAM的應用價值。

抗原檢測可以克服抗體檢測不能鑒別是MTB的急性感染還是以往對MTB的暴露，能解決TB早期診斷的缺陷。大量研究表明[17-18]，在結核病患者體液，如痰、血液、胸腔積液和腦脊液，特別是尿液中，都能檢測到LAM抗原，檢測的敏感性為20%～91%，特異性為83.3%～100%。國內尚無檢測LAM抗原的商業化試劑盒，因此還需要我們進一步加強對LAM抗體制備和LAM抗原檢測的研究探索。

[1] Murray C J，Salomon J A.Modeling the impact of global tu?berculosis controlstrategies[J].Proc NatlAcad SciUSA，1998，95(3):13881-13886.

[2] Murase T,Zheng R B,Joe M,et al.Structural insights into antibody recognition of mycobacterial polysaccharides[J].J Mol Biol,2009,392(2):381-392.

[3] Wu X,Yang Y,Zhang J,et al.Comparison of antibody re?sponses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Chim Acta,2010,411(19-20):1520-1528.

[4] Hunter S W,Gaylord H,Brennan P J. Structure and antige?nicity of the phosphorylated lipopolysaccharide antigens from the leprosy and tubercle bacilli[J].J Biol Chem,1986,261(26):12345-12351.

[5] Chatterjee D,Bozic C M,McNeil M,et al.Structural features of the arabinan component of the lipoarabinomannan of Myco?bacterium tuberculosis[J].J Biol Chem,1991,266(15):9652-9660.

[6] Kaplan G,Gandhi R R,Weinstein D E,et al.Mycobacteri?um leprae antigen-induced suppression of T cell proliferation in vitro[J].J Immunol,1987,138(9):3028-3034.

[7] Chan J,Fan X,Hunter S W,et al.Lipoarabinomannan,a pos?sible virulence factor involved in persistence of Mycobacteri?um tuberculosis within macrophages[J].Infect Immun,1991,59(5):1755-1761.

[8] Chujor C S N,Kuhn B,Schwerer B,et al.Specific inhibition of mRNA accumulation for lymphokines in human T cell line Jurkat by mycobacterial lipoarabinomannan antigen[J].Clin Exp Immunol,1992,87(3):398-403.

[9]Moreno C,Taverne J,MehlertA,etal.Lipoarabinomannan from Mycobacterium tuberculosis induces the production of tu?mornecrosisfactorfrom human and murine macrophages[J].Clin Exp Immunol,1989,76(2):240-245.

[10]Hetland G,Wiker H G,Hoga?sen K,et al.Involvement of an?tilipoarabinomannan antibodies in classical complement activa?tion in tuberculosis[J].Clin Diagn Lab Immunol,1998,5(2):211-218.

[11]Pitarque S,Larrouy-Maumus G,Payré B,et al.The immuno?modulatory lipoglycans,lipoarabinomannan and lipomannan,are exposed at the mycobacterial cell surface[J].Tuberculosis(Edinb),2008,88(6):560-565.

[12]Eleftheriadis T,Tsiaga P,Antoniadi G,et al.The value of se?rum antilipoarabinomannan antibody detection in the diagnosis of latent tuberculosis in hemodialysis patients[J].Am J Kid?ney Dis,2005,46(4):706-712.

[13]Tessema T A,Bjune G,Hamasur B,et al.Circulating antibod?ies to lipoarabinomannan in relation to sputum microscopy,clinical features and urinary anti-lipoarabinomannan detection in pulmonary tuberculosis[J].Scand J Infect Dis,2002,34(2):97-103.

[14]Leopold K,Fischer W.Molecular analysis of the lipoglycans of Mycobacterium tuberculosis[J].Anal Biochem,1993,208(1):57-64.

[15]Hamasur B,Ka?llenius G,Svenson S T.A new rapid and simple method for large-scale purification of mycobacterial li?poarabinomannan[J].FEMS Immunol Med Microbiol,1999,24(1):11-17.

[16]Sada E,Aguilar D,Torres M,et al.Detection of lipoarabino?mannan as a diagnostic test for tuberculosis[J].J Clin Microbi?ol,1992,30(9):2415-2418.

[17]Flores L L,Steingart K R,Dendukuri N,et al.Systematic re?view and meta-analysis of antigen detection for the diagnosis oftuberculosis[J].Clin VaccineImmunol,2011,18(10):1616-1627.

[18]Lawn S D.Point-of-care detection oflipoarabinomannan(LAM)in urie for diagnosis of HIV-associated tuberculosis:a state of the art review[J].BMC Infect Dis,2012,12:103.