毒素蛋白CcdB在載體構建中的研究及應用

范凱榮，覃石磊，黃進波，晁耐霞

廣西醫科大學 基礎醫學院，廣西 南寧 530021

Ccd（control of cell division or death system）系統位于大腸桿菌F質粒上，與細菌分裂后生存和SOS修復誘導有關，也是最早被發現、目前研究最為深入的一種毒素-抗毒素系統（toxin-antitoxin sys?tem，TA系統）[1]。ccd系統編碼2個蛋白，分別是毒素蛋白CcdB和抗毒素蛋白CcdA。毒素蛋白CcdB通過使細菌促旋酶失活而導致細菌死亡，CcdA可通過直接結合CcdB蛋白形成復合體解除其毒性。由于細胞內CcdA蛋白相對于CcdB蛋白比較易降解，從而導致丟失F質粒的子代細菌的死亡[2]。這一原理被廣泛應用于各種高效低背景質粒的載體構建中，廣泛應用于基因克隆和基因功能的研究。

1 ccd系統及其致死效應作用原理

1.1 ccd系統的組成及結構

ccd 系統定位于大腸桿菌 F 質粒的 42.9～43.6 kb，毒素蛋白基因ccdB與抗毒素蛋白基因ccdA位于同一個操縱子內，前后相鄰排列[3]。毒素蛋白CcdB（相對分子質量為11.7×103）比較穩定，有5個反向平行β折疊緊接著C端的α螺旋，其中的一個β折疊上有3個小的翼型折疊，上面含有LysC蛋白水解切割位點和CcdA識別位點[4]。抗毒素蛋白CcdA（相對分子質量為8.7×103）比較不穩定，在細胞內易被Lon蛋白酶水解；其N端結構域是DNA結合結構域，能夠特異性識別位于ccd操縱子上6 bp的DNA啟動子區域（回文結構），通過帶正電荷的折疊插入DNA的大溝起到調節作用，其C端與CcdB蛋白結合[5]。

1.2 ccd系統致死效應作用原理

研究認為，CcdB蛋白主要通過捕捉斷裂的DNA-促旋酶復合體并使細胞內拓撲異構酶失活，從而干擾DNA的合成，進而殺傷宿主細胞。促旋酶是原核生物細胞中高度保守的酶，屬于拓撲異構酶Ⅱ，導入負超螺旋進入同一閉合雙鏈DNA中。由于在高等生物中缺乏促旋酶類似物，因此促旋酶是抗生素類藥物研究的重要靶標。大腸桿菌的促旋酶為四聚體，由2個GyrA亞基和2個GyrB亞基組成。促旋酶能夠識別DNA超螺旋[6]，促旋酶GyrA二聚體的N端相對分子質量為60×103的結構域可以切斷DNA雙鏈，形成DNA門（DNA gate）。GyrA亞基C端與臨近DNA門的一段DNA（T segment，又稱DNA T片段）纏繞變構后與GyrB亞基N端結構域結合。GyrB的N端結構形狀類似于鉗子，與1分子ATP結合變構形成閉合狀態，易于捕獲DNA T片段。GyrB水解ATP后發生旋轉，牽引DNA T片段從DNA門處移出，DNA門重新連接，DNA分子導入2個負超螺旋，最后GyrB再結合1分子ATP并水解，促旋酶2個亞基解離分開。CcdB蛋白能夠捕捉斷裂的DNA-促旋酶復合體并與之結合形成穩定的復合體，阻止促旋酶發揮活性，這一復合體導致DNA復制的終止。同時也有研究證實，這一復合體也能阻滯RNA聚合酶的前進，最終導致轉錄終止。分析CcdB-GyrA的晶體結構得知，當DNA呈線性結構時，促旋酶上的信息才會誘導CcdB發揮致死作用[7-9]。

CcdB的致死作用可被抗毒素蛋白CcdA抑制。CcdA分子的C端可與CcdB上2個部分重疊的位點實行連續的非共價結合，并引發CcdB構象改變，使得CcdB-促旋酶復合體因為局部構象的改變而出現分離[10]。CcdA的C端41個氨基酸殘基是結合CcdB的必需殘基。不同的自然壞境下CcdA和CcdB的結合模式會發生改變，其結合模式依賴于兩者間的濃度比，即CcdA與CcdB之間的比率大于等于1時，二聚物（CcdA）2和（CcdB）2相互交替組成鏈狀四聚體（CcdA）2（CcdB）2時，CcdA對CcdB有抑制作用；相反，當CcdA與CcdB之間的比率小于1時，就會形成六聚體（CcdA）2（CcdB）4，此時CcdA對CcdB無抑制作用[11]。此外，（CcdA）2（CcdB）2復合體還能抑制ccd操縱子的轉錄，這一功能主要通過復合體中CcdA蛋白與ccd操縱子啟動子區域的結合來實現，CcdB的結合促進CcdA與DNA的親和性增高，結合區域位于ccdB開放讀框起始位點上游113 bp處。因此，不同的CcdA和CcdB間的濃度比，也決定ccd操縱子的開與關，從而使兩者的含量處于動態平衡中，以精確地調控細菌的生長[12]。

2 CcdB在質粒載體構建中的應用

2.1 ccdB基因在載體構建中的應用原理

基因克隆和表達是基因組學和蛋白組學研究的基礎，目前基因克隆過程中重組體篩選系統通常采用遺傳檢測方法，即抗藥性標記插入失活、β-半乳糖苷酶顯色反應和插入序列表性特征等，能夠鑒別陽性克隆和陰性克隆，但也伴有多種因素造成的不可避免的假陽性克隆問題，以及繁瑣的驗證工作量。將ccdB同源基因同框融合進入重組質粒，重組質粒編碼的CcdB蛋白對宿主細胞具有致死效應；而在該同源基因內插入外源基因片段，則導致ccdB讀框移碼突變，編碼的CcdB蛋白喪失了對宿主的毒性，從而使重組表達質粒在宿主細胞內生存繁殖生存，最終達到陽性篩選的作用，同時也能有效降低背景陰性克隆和假陽性克隆，極大地減少了驗證工作量。自Bernard和Couturier等發現促旋酶突變的大腸桿菌促旋梅突變體（GyrA Arg462→Cys）對CcdB蛋白的毒性耐受[13]，使得CcdB蛋白被廣泛應用于高效低背景的質粒載體構建。此外，CcdB毒性往往與抗藥性標記插入失活或β-半乳糖苷酶顯色反應一起應用于基因克隆重組子的篩選，大大提高了篩選陽性克隆的效率。

2.2 ccdB基因在載體構建中的應用

目前ccdB基因同源片段已用于多種高效低背景質粒載體的構建，如TA克隆載體、平末端克隆載體、表達載體等，這些載體廣泛應用于細菌、真菌、植物和動物基因的功能研究，詳見表1。

最先將ccdB基因引入載體構建的是比利時的Philippe等，他們將ccdB基因與pUC18/19質粒的lac啟動子后的多克隆位點區域同框融合，構建衍生的質粒pKIL18/19，將該衍生質粒轉化進入促旋酶野生型的大腸桿菌后能抑制細菌的生長；而當ccdB基因被外源片段插入后，則沒有抑制細菌生長的功能，在豐富培養基上才可以形成可見的克隆[14]。

表1 利用ccdB基因構建的載體舉例

TA克隆法因操作簡單、快速高效，而被廣泛應用于基因工程，多數實驗室對目的基因的克隆常選用TA克隆法，利用ccdB構建的載體克隆率較高。陳其軍等設計的引物在ccdB片段兩端分別引入一個AhdⅠ酶切位點，并對模板進行PCR擴增，利用定點突變方法沉默pBlueScriptSK（-）載體中Amp抗性基因的AhdⅠ酶切位點，獲得骨架pSKAΔhd，將PCR產物與pSKAΔhd分別用SalⅠ、XbaⅠ雙酶切，經連接反應，獲得前T載體pSK01（pSK02和pSK03構建方法相同），經AhdⅠ酶切即得T載體。他們通過克隆 NCED3（1.8 kb）和 DREB1A（0.68 kb）進行驗證，克隆率均為100%（除pSK03與DREB1A克隆率為96%外）。另外，ccdB在該載體構建中除致死效應外，還起到間隔作用，解決了非重組轉化子的本底過高的問題。但TA克隆法仍存在加尾效率和連接效率低等問題[15-16]。

近年來，Hu等用ccdB片段構建出平末端載體，既避免了TA克隆法中加尾效率等問題，又可降低假陽性克隆率。該課題組首先對3對寡聚核苷酸鏈進行PCR擴增，在5'端和3'端分別引入Eco31Ⅰ位點，PCR擴增產物經Eco31Ⅰ酶切、連接成環狀ccdB基因，再與骨架pUC18分別用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，連接獲得前載體pUC-ccdB，經EcoRⅤ或SmaⅠ酶切即得平末端載體。實驗者用不同大小的PCR產物進行驗證，93 bp插入片段可使ccdB基因失活；3000 bp片段的轉化效率為每毫克DNA轉化數3×105～5×105，且無假陽性克隆轉化子[17]。

ccdB基因片段還可插入載體構建表達載體。pGR-PSLIC、pJL-PSLIC、pMBP1-PSLIC是基于LIC的植物表達載體，在其構建過程中將SnaBⅠ位點分別引入骨架載體和ccdB片段，ccdB插入骨架載體2個LIC連接位點之間，所得前載體經SnaBⅠ酶切即可獲得表達載體。該系列載體可為植物基因組學研究提供高效、高產量的表達分析工具[18]。

2.3 利用ccdB構建載體技術的商業化

Invitrogen公司已推出多種克隆技術，并利用ccdB進行了改進。Gateway技術即利用了ccdB選擇方法，確保高效率的分離重組克隆，典型的效率高于95%。Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdb Survival Competent Cells，就是通過在中間載體2個重組位點間添加ccdB篩選標記來實現的。Zero Background技術采用ccdB基因，能夠進行高效克隆，產生近100%的重組體。Topo平端克隆技術主要改良載體設計，把ccdB基因插入多克隆位點，改善了傳統TA克隆高背景的缺點，并節省篩選時間。Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒結合了Zero Background技術和pCR-Blunt II-TOPO載體中的TOPO克隆，能簡單、高效地對使用高保真PCR酶生成的平端PCR產物進行DNA克隆。

3 結語

目前，以ccdB基因作為陽性選擇的標記物應用到高效零背景載體的構建已成為基因工程研究的重要方法。但ccdA、ccdB基因家族僅在5種革蘭陰性菌中有發現，且表達功能不甚相同，因此，研究ccdA、ccdB基因家族的功能和分布特點，以及誘導對大部分細菌有抑制作用的CcdB蛋白表達，將為CcdB的廣泛應用奠定基礎。此外，如何將ccdB與其他篩選標記聯合應用從而達到更高效的篩選效果，是未來利用ccdB構建載體的另一個發展方向。

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