高靈敏的蛋白質免疫印跡新方法用于β-淀粉樣蛋白檢測

馮愛平，扎拉嘎胡，李威，劉英富

1.四川省德陽市第二人民醫院 神經外科，四川 德陽 61800；2.武警后勤學院 細胞生物學與醫學遺傳學教研室，天津300162

蛋白質免疫印跡法（Western印跡）是根據抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記對受檢物質進行檢測的一種有效方法[1]，結合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優點。與免疫沉淀法比較，這種方法無須對靶蛋白進行同位素標記。該方法檢測能力強，對檢測樣本的要求低，可避免溶解、聚集及靶蛋白與外來蛋白共沉淀等諸多問題[2]。

該方法的優點是：可以從混雜抗原中檢測出特定抗原；可以從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體；可以對轉移到固相膜上的蛋白質進行連續分析；蛋白質反應具有均一性；固相膜保存時間長；顯色靈敏等。其不足之處：干擾因素較多；易造成結果失真；通過條帶的有無和灰度深淺來對陽性結果做出判斷有時會帶來誤差；實驗操作過程中須消耗大量昂貴抗體等。這些因素大大限制了其應用[3]。

鑒于目前Western印跡存在的局限性，我們在抗體上引入了納米金粒子（Au nanoparticles，AuNP）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。這2種材料都具有制備過程簡單、比表面積大、易與蛋白質結合、能保持抗體生物活性等優點，在生物學方法中得到了廣泛應用。我們將抗體與AuNP和GO結合后，引入傳統的Western印跡方法中，逐級放大檢測信號，以降低Western印跡的檢測限，擴大該方法的適用范圍和領域[4-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

含β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的血清來自北京腫瘤醫院；Aβ一抗（Aβ-Ab1）、辣根過氧化物酶標記的二抗（Ab2-HRP）購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自Sigma-Aldrich公司；石墨烯購自Alfa Aesar公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自南京市威圣化工貿易有限公司；檸檬酸鈉購自上海 創 順 化 工 有 限 公 司 ；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20購自北京化學試劑公司；實驗用水為雙蒸水。

Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；SORVSLL型LEGEND MICRO 17離心機（Therno公司）。

1.2 AuNP與AuNP-Aβ-Ab1的制備

首先將l mL 1%的氯金酸溶液加入100 mL雙蒸水中，加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，充分攪拌，保持沸騰15 min。這期間溶液顏色依次由灰變藍再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16 nm的AuNP顆粒，4℃下保存備用。

將0.3 mg Aβ-Ab1加入pH6.0的AuNP溶液中，室溫下攪拌2 h，然后加入2 mL 1%的BSA，室溫封閉30 min，13 300 r/min離心10 min，溶液分成上下2層，上層為未結合的抗體，下層為黑色、松軟的結合物。除去上清，用含1%BSA的PBS緩沖液將產物（AuNP-Aβ-Ab1）洗滌并離心3次，最后溶于PBS中，置4℃備用，該產物能在1個月內保持活性[10]。

1.3 GO和GO-Ab2-HRP的制備

石墨烯（又稱單層石墨或二維石墨）是單原子厚度的二維碳原子晶體，被認為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結構單元。石墨烯因具有大的比表面積、突出的導熱性能和力學性能，及非凡的電子傳遞性能等一系列優異性質，被業內人士廣泛關注[11]。制備氧化石墨烯的方法很多，而將石墨氧化變成氧化石墨，再在超聲條件下容易得到單層的氧化石墨烯溶液，已成為氧化石墨烯制備的有效途徑。

將0.5 g石墨粉末和0.5 g硝酸鈉加入23 mL預冷的濃硫酸中，攪拌反應10 min，然后緩慢加入4 g高錳酸鉀，35℃反應1 h，再向反應體系中緩慢加入40 mL蒸餾水，95℃反應1 h，加入100 mL蒸餾水終止反應，然后加入2 mL 30%的H2O2，室溫反應2 h，將產物離心，并用1 L的HCl（5%）洗滌，隨后用4 L蒸餾水洗滌，離心并再次洗滌。將得到的產物于40℃真空干燥48 h，即為GO粉末，置4℃備用[12]。

將50 mg NaOH和ClCH2COONa加入1 mL 1 mg/mL的GO中，超聲波裂解1.5 h，將產物GOCOOH用雙蒸水洗滌3次，除去過量的堿，然后將400 mmol/L EDC和200 mmol/L NHS一起加入1 mL pH6.0的MES緩沖液中，反應30 min，將混合物于13 300 r/min離心5 min，除去上清，此過程重復3次。將得到的GO-Ab2-HRP溶于含1%BSA的1.0 mL pH7.4 的PBS中，置4℃備用[13-14]。

2 結果與討論

2.1 納米載體與抗體結合體的制備

圖1A為AuNP的透射電鏡圖，可以看出AuNP為黑色球狀物，粒徑為16 nm。圖1B為AuNP-Aβ-Ab1的透射電鏡圖，中間黑色球狀物為納米金，而包裹著納米金的絮狀物為Aβ-Ab1。為了得到分散均勻、大小勻稱的納米金顆粒，首先應將所用器皿依次用王水（濃HCl∶濃HNO3=3∶1）和雙蒸水沖洗，烘干待用。此步驟需要絕對清潔的器皿，任何雜質都會讓形成的納米金顆粒團聚。

圖2A為GO的透射電鏡圖，圖2B為GO-Ab2-HRP的透射電鏡圖，上面的黑色斑點為結合在GO片上的抗體。為保證氧化石墨烯與二抗的結合率，又不破壞抗體的活性，在由石墨制備得到氧化石墨烯后，要用去離子水透析GO-COOH懸浮液48 h以上，以除去所有離子，因為雜質粒子的存在對氧化石墨烯與抗體的結合會產生非常不利的影響。另外，加入的EDC要過量，因為EDC遇水迅速發生水解，量太少則不能發揮縮合的作用。

2.2 改進后的Western印跡方法評價

圖1 AuNP（A）和AuNP-Aβ-Ab1（B）的透射電鏡圖

圖2 GO（A）和GO-Ab2-HRP（B）的透射電鏡圖

將抗體功能化的納米金和氧化石墨烯進行Western印跡，本研究所用樣品為Aβ。Aβ是阿爾茨海默病（AD）中病理改變的主要成分，其毒性作用亦可誘導神經細胞凋亡。該蛋白在腦損傷后的表達，與傷情、傷后認知功能障礙、AD及中樞神經病理生理變化密切相關，研究其在腦外傷后腦組織中的表達情況可以判斷傷情、評估預后，對腦外傷的治療有重要意義[15]。現在普遍認為Aβ的聚集在AD發生、發展過程中起核心作用，Aβ導致神經細胞功能紊亂和死亡，最終引起癡呆[16]。

改進后Western印跡檢測Aβ的具體步驟如下。

2.2.1 樣品準備及電泳 將血清按照一定比例稀釋，同時制備2塊電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

2.2.2 轉膜 ①電泳結束后將膠條切至合適大小，用轉膜緩沖液平衡5 min，共3次；②膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜，浸入轉膜緩沖液中10 min；③轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、陰極的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對齊，每一步都要做去除氣泡處理，接通電源，轉移1.5 h，結束后斷開電源將膜取出。

2.2.3 免疫反應 ①用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共3次；②加入包被液，室溫下平穩搖動2 h；③棄包被液，用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共3次；④其中一塊膜加入常規一抗，另一塊加入功能化修飾過的一抗，用BSA封閉，37℃放置2 h以上；⑤棄一抗和1%BSA，用0.01 mol/L PBS洗膜3 min，共3次；⑥在步驟④中加入常規一抗的膜在本步驟中加入Ab2-HRP，加入納米金功能化修飾的一抗的膜在本步驟中加入GO-Ab2-HRP，37℃平穩搖動1 h；⑦棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共4次；⑧加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應（圖3）。

傳統Western印跡方法中，每一個抗原蛋白只能結合一個對應一抗，而每個一抗也只能結合一個二抗；而在改進后的方法中，通過納米金載體與多個一抗結合，每個抗原蛋白能夠結合多個一抗；通過氧化石墨烯與二抗結合，每個一抗能連接多個酶標記二抗，通過2次串聯放大作用，能將較低的檢測信號逐級放大，提高了檢測的靈敏度。

為了考察改進后方法的性能，用與納米金顆粒結合的一抗和與氧化石墨烯結合的二抗對Aβ進行檢測，結果見圖4。改進方法比傳統方法多出3條帶，可檢測到濃度為16 pg/mL的樣品，檢測限降低為傳統方法的1/27。重復實驗結果表明，改進后的方法性能穩定，重復性好，可用于對樣本中低濃度蛋白質進行靈敏檢測。

2.3 結論

將納米金和氧化石墨烯引入Western印跡中，提高了一抗與抗原、二抗與一抗的結合比例，可對檢測信號逐級放大，提高了方法的靈敏度，拓展了該檢測方法的應用領域。且改進后的方法重復性好，操作簡便，將會在蛋白質檢測和診斷學研究中發揮其應有的作用。

圖3 改進的Western印跡操作流程示意圖

圖4 改進前（A）、后（B）的Western印跡方法對Aβ的檢測結果1～7：樣品濃度依次為11 664、3888、1296、432、144、48和16 pg/mL

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