雷諾嗪緩釋片在比格犬體內的藥代動力學

孟慶芳，陳知航，車津晶，劉運龍，單成啟，錢小紅，程遠國

1.北京理工大學 生命學院，北京 100081；2.軍事醫學科學院 微生物流行病研究所，北京 100071；

3.軍事醫學科學院 放射醫學研究所，國家蛋白質組學重點實驗室，北京蛋白質組研究中心，北京 102206

心絞痛是較常見的心血管疾病，隨著人們生活水平的提高和生活方式的變化，其發病率呈連續上升趨勢。公認的抗心絞痛藥的基本模式為：提高心肌氧的供需平衡，增加冠脈流量或降低心肌機能或兩者兼有。目前，廣泛應用于缺血性心臟病的藥物包括硝酸酯類、β-腎上腺素能受體阻滯劑、鈣離子通道拮抗劑等，這些藥物均是通過減慢心率、降低血壓或削弱心臟泵血功能，從而使心臟做功減少，以緩解心絞痛癥狀，但同時對已經衰竭的心臟功能也有產生進一步損害的可能。因此，研究人員一直致力于尋找其他更有效且副作用少的療法來改善心肌缺血，代謝途徑治療這一理論上可行的新手段便應運而生。此種治療方法通過優化心肌能量供應的代謝，抑制脂肪酸的β-氧化，進而活化丙酮酸脫氫酶，增加葡萄糖氧化，由于在產生等量的ATP的前提下，葡萄糖氧化比脂肪酸氧化節約10%～15%的耗氧量，使得心肌在缺血缺氧時能提高氧的利用率，使心臟做功更多[1-3]。通過代謝途徑治療從而改變心臟代謝方式的代表藥物是美國CV Therapeutics公司最新研制的部分脂肪酸氧化抑制劑雷諾嗪（化學分子式為 C24H33N3O4，分子量427.54，化學結構見圖1），已獲得美國FDA批準上市。為減少服藥次數，避免血藥濃度的波動過大，減低毒副作用，北京某醫藥公司開發了雷諾嗪緩釋片。我們受該公司委托，對其開發的雷諾嗪緩釋片進行了臨床前藥物代謝動力學研究，并與參照制劑雷諾嗪片比較，為其是否具有緩釋特征提供依據。雷諾嗪的液相色譜與單級質譜聯用檢測方法此前有文獻報道[4]，但其靈敏度無法滿足本實驗要求，故本實驗擬建立一種靈敏度高、準確可靠的液相色譜與串聯質譜聯用的檢測方法來對比格犬體內藥物濃度進行定量分析，并對雷諾嗪緩釋片和雷諾嗪片的藥代動力學特征進行比較分析，為了解雷諾嗪緩釋片在比格犬體內的藥代動力學過程提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

健康比格犬12只［北京協爾鑫生物資源研究所提供，體重 3.5～4.6 kg，許可證號 SCXK（京）2005-0005］，飼養于動物房，定時排風，光照良好，常溫，自由飲水，每日進食2次，實驗前禁食12 h。

1.2 材料

雷諾嗪標準品（批號070223）、緩釋片（批號071210）、參比片均由北京某醫藥公司提供，規格為500 mg/片，陰涼干燥處保存。

內標物鹽酸維拉帕米（化學分子式為C27H38N2O4·HCl，分子量491.07，化學結構見圖 2）對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號100223-200102），4℃、遮光、密閉保存。

試驗所用甲醇、乙腈購自Fisher Scientific公司，色譜純；甲酸購自Tedia公司，純度為96%；超純水采用軍事醫學科學院自制去離子水，經0.2 μm微孔濾膜過濾。

Agilent1100（Wilmington公司）液相系統包括真空脫氣機、四元泵、自動進樣器和柱溫箱；API4000三重四極串聯質譜（Applied Biosystems公司）；TDL5M臺式大容量冷凍離心機（Sigma Laboratory Centrifuges）；BF-2000M型氮氣吹干儀（北京八方世紀公司）。

1.3 服藥方案與采血時間

采用隨機對照試驗設計。將12只比格犬隨機分為A、B組，每組6只。

受試動物禁食過夜，A組于試驗當日8∶00空腹口服給予受試制劑雷諾嗪緩釋片（500 mg/片）1片。給藥前抽取空白血樣2 mL，給藥后15、30、45 min和1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由后肢外側皮下小隱靜脈取血各約2 mL，肝素抗凝，立即離心，分離血漿，置-20℃保存備測。

B組于試驗當日8∶00空腹口服給予參比制劑雷諾嗪片（500 mg/片）1片。給藥前抽取空白血樣2 mL，給藥后10、20、30、45 min和1、1.5、2、3、4、6、8、12 h由后肢外側皮下小隱靜脈取血各約2 mL，肝素抗凝，立即離心，分離血漿，置-20℃保存備測。

圖1 雷諾嗪的化學結構式

圖2 鹽酸維拉帕米的化學結構式

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18柱（50 mm×2.1 mm，粒徑5 mm），流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙腈，流速0.2 mL/min。采用梯度洗脫模式，洗脫程序詳見表1。柱溫為室溫，進樣量20 μL。

1.5 質譜條件

以鹽酸維拉帕米為內標，按內標法定量。以高純氮氣作為碰撞氣、源內氣體和氣簾氣，ESI源正離子模式下MRM掃描方式。測試前質譜通過靈敏度和質量準確度校正實驗。離子源參數：碰撞氣（colli?sion gas）壓力 6 psi，氣簾氣（curtain gas）壓力 10 psi，源內氣體 1（gas1）壓力45 psi，源內氣體2（gas2）壓力50 psi，離子噴霧電壓（ion spray voltage）5000 V，溫度500℃。

用于定量分析的離子對分別為雷諾嗪428.5/279.2（其中279.2是雷諾嗪的子離子）（圖3A）和鹽酸維拉帕米456.5/165.2（其中165.2是維拉帕米的子離子）（圖3B）。化合物參數見表2。

1.6 血漿樣品處理

取血漿50 μL，加入內標工作液（500 ng/mL維拉帕米水溶液）50 μL，混勻，加入1 mL乙醚旋渦混合4 min，16 000 r/min離心5 min，吸取上清液，殘渣加入1 mL乙醚重復提取一次，上清與第一次上清合并后，通入高純氮氣揮干，殘渣用200 μL溶解液（5%乙腈∶水）溶解，16 000 r/min離心5 min，進LCMS/MS，進樣量為20 μL。由藥物峰面積與內標的峰面積比在各自的標準曲線上求得雷諾嗪濃度。

1.7 標準工作曲線和質控樣本的制備

在每個離心管中分別加入50 μL空白比格犬血漿，加入雷諾嗪標準系列（濃度分別為 4.88、9.77、19.5、39.1、78.1、156、312、625、1250、2500、5000 ng/mL）溶液50 μL和500 ng/mL內標維拉帕米水溶液，制成標準血漿樣本。

表1 色譜洗脫程序

表2 用于定量分析的化合物參數設置

QC樣品同法操作，分低、中、高三個濃度，雷諾嗪終濃度分別為9.77、625、5000 ng/mL。

內標溶液臨用時用溶解液5%乙腈∶水稀釋至500 ng/mL。

1.8 方法學驗證

1.8.1 專屬性 取正常比格犬空白血漿，按1.6項下方法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖；將1號受試比格犬口服1片雷諾嗪緩釋片后1.5 h的血漿樣品依同法操作，獲得相應的色譜圖。將空白血漿色譜圖和給藥后犬血漿色譜圖相比較，得知空白血漿對樣品檢測有無干擾。

1.8.2 線性關系及檢測限 取標準血漿樣本，按1.6項下方法操作，記錄待測物及內標的峰面積。以雷諾嗪和內標維拉帕米面積比（Y）與雷諾嗪濃度（C：ng/mL）進行線性回歸（內標濃度為500 ng/mL），得回歸方程和線性關系。

取6份空白血漿（各50 μL），分別加入4.88 ng/mL雷諾嗪標準溶液50 μL，制成檢測線標準血漿樣本6份，按照1.6項下方法操作，根據隨行標準曲線計算準確度、精密度，判斷是否符合檢測下限要求。

1.8.3 提取回收率與基質效應 將含雷諾嗪質量濃度分別為9.77、625和5000 ng/mL各5份的200 μL標準品溶液（5%乙腈∶水）進樣，分析記錄雷諾嗪和內標峰面積。此時雷諾嗪面積記為“A”。

另取比格犬空白血漿100 μL，加入1 mL乙醚，按照前述2次液液萃取方法得到空白血漿提取物，將此空白血漿提取物加入含雷諾嗪濃度分別為9.77、625和5000 ng/mL各5份的200 μL標準品溶液（5%乙腈∶水）溶解，離心進樣，分析并記錄雷諾嗪和內標峰面積。此時雷諾嗪面積記為“B”。

按1.7項標準工作曲線和質控樣本制備方法，制備含雷諾嗪濃度分別為9.77、625和5000 ng/mL的血漿質控樣品各5份，按1.6項方法操作，分別記錄雷諾嗪和內標峰面積。此時雷諾嗪面積記為“C”。

圖3 雷諾嗪子離子279.2（A）和維拉帕米子離子165.2（B）的化學結構式

以雷諾嗪血漿樣品峰面積（C）與外加空白血漿提取物的雷諾嗪標準品峰面積（B）的比值計算提取回收率；以外加空白血漿提取物的雷諾嗪標準品峰面積（B）與雷諾嗪標準品峰面積（A）的比值計算基質效應。

1.8.4 準確度及精密度 按1.7項下標準曲線和質控樣本的制備方法制備含雷諾嗪低、中、高三個濃度的QC樣品，根據當日工作曲線，分別計算QC樣品的測得濃度，與理論濃度對照，求得測定方法的準確度與精密度，在同一天內測定5次，按回歸方程計算濃度，計算日內精密度變異系數。

1.8.5 血漿樣品穩定性考察 按1.7項下標準曲線及質控樣本制備方法，分別配制空白比格犬血漿中的低、中、高三個濃度的QC樣品，每個濃度各5份，在-20℃冰箱中冷凍后取出，室溫融化，重復操作3次，按1.6項操作，計算雷諾嗪的濃度，考察樣品在3次凍融過程中是否穩定。

按1.7項下標準曲線及質控樣本制備方法，分別配制大鼠血漿中的低、中、高三個濃度的QC樣品，每個濃度各5份，在-20℃冰箱中放置，分別在0、30 d取樣，按1.6項操作，計算雷諾嗪的濃度，考察樣品在30 d凍存過程中是否穩定。

1.9 數據處理及統計

所有原始數據在Analyst 1.4.2軟件中轉換為血藥濃度-時間數據，并按照隨行標準曲線得到回歸方程。在Excel 7.0軟件中按梯形法則計算AUC，非房室模型統計矩法估算其他藥動學參數，達峰時間tmax與峰濃度Cmax用實測值。用Origin6.0軟件作圖。

2 結果

2.1 方法學確證

2.1.1 專屬性 空白血漿樣品和1號受試比格犬口服雷諾嗪緩釋片后1.5 h的血漿樣品的色譜圖見圖4。雷諾嗪的保留時間約為5.5 min，內標維拉帕米的保留時間約為5.8 min。內源性物質基本不干擾測定，方法專屬性強。

2.1.2 線性關系及檢測限 以雷諾嗪和內標維拉帕米的面積比（Y）與雷諾嗪濃度（C：ng/mL）進行線性回歸（內標濃度為500 ng/mL），得回歸方程血漿中雷諾嗪線性范圍為4.88～5000 ng/mL，該濃度范圍內與峰面積比線性良好。

按照隨行標準曲線計算血藥濃度，6份理論濃度為4.88 ng/mL的樣本中雷諾嗪的實測濃度分別為5.06、5.13、4.75、4.92、4.67、4.59 ng/mL（表 3），準確度、精密度均符合80%～120%規定范圍，所以血漿中雷諾嗪最低定量濃度為4.88 ng/mL。

2.1.3 提取回收率與基質效應 提取回收率和基質效應考察結果見表4。提取回收率約為60%，基質效應在80%～120%范圍內，顯示空白血漿提取物即基質對標準品的色譜相應信號沒有明顯的抑制或增強作用，基本可以不考慮基質效應。

2.1.4 準確度及精密度 準確度和精密度考察結果見表5。日內精密度變異系數低于11.37%，準確度為101.0%～104.9%。對質控樣品每個濃度進行5樣本分析，連續測定3 d，日間精密度變異系數低于9.13%，準確度為97.7%～102.7%。

圖4 空白血漿（A）和1號受試比格犬口服雷諾嗪緩釋片后1.5 h的血漿樣品（B）色譜圖藍色為雷諾嗪，紅色為內標維拉帕米

表3 定量下限考察結果

表4 雷諾嗪血漿提取回收率

2.1.5 血漿樣品穩定性考察 血漿樣品穩定性考察結果見表6。雷諾嗪血漿樣本經過3次凍融過程和在-20℃條件下放置30 d內穩定。

2.2 比格犬體內雷諾嗪緩釋制劑、參比制劑的藥代動力學

給藥后受試組、參照組比格犬平均血藥濃度-時間變化比較見圖5。表7為單次給藥后參照組和受試組個體比格犬的主要藥代動力學參數。按成組設計實驗Student t檢驗等方差雙樣本（雙尾分布）檢驗方法對受試組和參照組藥代參數進行統計學分析，計算P值，受試組與參比組相比，曲線下面積AUC0～∞、清除率Cl、表觀分布容積Vd沒有統計學差異，而達峰時間Tmax、峰濃度Cmax、平均駐留時間MRT、半衰期t1/2、消除速率常數Kel有明顯差異。表明雷諾嗪緩釋片與參照片相比，達峰時間、半衰期、平均駐留時間明顯延長，峰濃度和消除速度常數明顯降低，符合緩釋片的基本藥代動力學特點。

表5 雷諾嗪質控樣本日內、日間精密度準確度考察結果

表7 單次給藥參照組和受試組主要藥代動力學參數及統計分析

圖5 雷諾嗪參照組和受試組平均血藥濃度-時間變化比較

3 討論

我們建立了比格犬體內的雷諾嗪血藥濃度LCMS/MS檢測方法，此法簡單易行、靈敏度比報道的單級質譜方法[4]高7倍，重現線性、穩定性、回收率等均滿足要求，可以用來檢測給藥后比格犬藥代動力學血漿樣本。

將此方法用于受試組與參照組比格犬的藥代動力學研究，2組犬血藥濃度-時間變化趨勢截然不同。參照組血藥濃度峰值遠高于受試組，有明顯的突釋效應；受試組血藥濃度則緩慢上升和下降，峰值較低。雷諾嗪緩釋片與參照制劑相比，達峰時間、半衰期、平均駐留時間明顯延長，峰濃度和消除速度常數明顯降低，符合緩釋片的基本藥代動力學特點。在后續工作中，將進行比格犬連續7 d給藥的多次給藥藥代動力學研究，以比較多次給藥后，雷諾嗪緩釋片與雷諾嗪片的藥代動力學特征的不同，進一步證明在比格犬體內雷諾嗪緩釋片的緩控釋特性。

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