小干擾RNA長期作用乙型肝炎病毒轉基因小鼠對機體免疫系統的影響

張衛云，石玉玲，孫朝暉，任廣立，張蓉 ，唐榮芝

廣州軍區 廣州總醫院 a.檢驗科；b.兒科；廣東 廣州 510010

據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染過乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中約4億人為慢性感染者，每年有超過100萬人死于HBV感染相關疾病。中國是HBV感染的高發地區，乙肝表面抗原攜帶者占全國人口的10%～15%。目前，針對慢性乙肝的抗病毒治療主要采用重組干擾素和以拉米夫定和阿德福韋為代表的核苷類似物，但迄今其治療效果不能讓人滿意，并伴有嚴重的副作用，停藥后的反彈和耐藥株的出現仍然是亟待解決的難題。自RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術發現以來，作為基因治療手段之一的RNAi已被證實是非常有開發前景的HBV治療手段之一[1-2]。RNAi是保守的進化機制，有利于對抗外來基因的入侵如病毒和轉座子等，是基因水平的抗病毒免疫機制。而小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）似乎對已存在的HBV共價閉合環狀DNA（covalently closed cir?cular DNA，cccDNA）沒有作用，徹底清除HBV尚有一定的困難。因此，從增強機體免疫應答的角度，探討siRNA長期作用HBV轉基因小鼠的機體免疫應答狀況是非常必要的。

1 材料和方法

1.1 材料

HBV全基因轉基因小鼠購自解放軍第458醫院全軍傳染病中心；正常BALB/c小鼠來自我院動物實驗室，于實驗室相對清潔環境飼養，體重（20±2）g，8～10周齡，雌雄分籠，穩定2周后進行實驗。實驗設立特異性siRNA組（pSilencer4.1/C2）、PBS對照組和正常BALB/c小鼠組，每組10只小鼠。

根據既往研究[3-5]，選擇pSilencer4.1/C2載體（本單位構建并保存）轉染HBV轉基因小鼠。

免疫球蛋白檢測采用德國SIEMENS公司生產的BNⅡ特種蛋白分析儀及配套試劑；細胞因子試劑盒由上海研吉生化科技有限公司提供，采用芬蘭Denley Drogon公司的Wellscan mk2酶標儀分析；CD4+和CD8+T淋巴細胞檢測采用美國BD公司生產的BD FACS Calibur流式分析儀及配套試劑。

1.2 方法

參照文獻[6-7]，用高壓水尾靜脈注射法將siRNA表達載體按5 mg/kg給藥，按小鼠體重的8%注入，均以 PBS（1.5～2.0 mL）稀釋，10 s左右完成注射。注射后1、3、6、9和12個月通過小鼠內眥靜脈采血，采用免疫散射比濁法測定小鼠血清中的IgG、IgA和IgM，ELISA法測定IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ，流式細胞術檢測小鼠外周血中的CD4+和CD8+T淋巴細胞。

1.3 統計學方法

用SPSS 17.0統計分析軟件對數據進行統計學分析，用t檢驗做差異的顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 長期siRNA治療后轉基因小鼠IgG、IgA和IgM水平的變化

用散射免疫比濁法檢測了3組小鼠的IgG、IgA和IgM水平。從圖1可以看出，隨著siRNA作用時間的延長，pSilencer4.1-C2組小鼠IgG、IgA、IgM的表達水平均顯著增加，至第9個月時幾乎接近于正常BALB/c小鼠組水平，與PBS組相比差異顯著（P＜0.05），而PBS組免疫球蛋白水平基本無改變。

2.2 長期siRNA治療后轉基因小鼠細胞因子表達水平的變化

用ELISA方法檢測了3組小鼠血清中相關細胞因子的水平。隨著siRNA作用時間的延長，pSilenc?er4.1-C2組小鼠的IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的表達有上調趨勢，水平顯著增加，至第12個月時幾乎接近于正常BALB/c小鼠組水平，與PBS組相比差異顯著（P＜0.05），而PBS組細胞因子水平基本無改變。見圖2。

2.3 長期siRNA治療后轉基因小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞的水平變化

為了解細胞免疫水平的變化，利用流式細胞術檢測了小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞的水平，并計算CD4+/CD8+T淋巴細胞的比值。pSilenc?er4.1-C2組在特異性siRNA長期治療下，轉基因小鼠CD4+和CD8+T淋巴細胞水平均有上升趨勢，與PBS組相比有顯著性差異（P＜0.05），治療后第9個月，CD4+和CD8+T淋巴細胞的水平接近正常BALB/c小鼠組，CD4+/CD8+T淋巴細胞的比值更接近于正常BALB/c小鼠組，而PBS組基本無改變。見圖3。

圖1 長期siRNA治療后不同時間點轉基因小鼠血清中IgG（A）、IgA（B）、IgM（C）水平的變化

圖2 長期siRNA治療后不同時間點轉基因小鼠血清中IL-2（A）、IL-4（B）、IL-6（C）、IFN-γ（D）水平的變化

圖3 長期siRNA治療后不同時間點轉基因小鼠外周血CD4+（A）、CD8+（B）T淋巴細胞水平的變化及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值（C）

3 討論

通常在機體免疫狀態好的情況下，急性HBV感染多容易被清除。但是當機體免疫功能低下時，不能產生有效的針對HBV的特異性細胞毒T淋巴細胞反應（CTL），從而不能有效地徹底清除HBV。病毒產生針對機體先天免疫的逃逸策略是HBV感染慢性化、持續化的主要原因之一[8-9]。實驗表明HBV感染可導致機體先天免疫降低，而特異性siRNA長期治療后細胞免疫和體液免疫水平均有上調，與PBS組相比差別具有顯著意義，而且在特異性siRNA長期作用下機體免疫功能接近正常BALB/c小鼠組，HBV轉基因小鼠通過提高血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgG、IgA、IgM和外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞水平來調節機體細胞免疫和體液免疫。

免疫球蛋白是具有抗體活性的動物蛋白，主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中，是機體體液免疫的物質基礎。在免疫系統中，免疫球蛋白參與體液免疫應答反應中的免疫特異性結合、與補體的結合及免疫調節。我們選用IgG、IgA、IgM進行分析，結果表明，與PBS組相比，pSilenc?er4.1-C2組的3種免疫球蛋白水平均顯著增加，至第9個月時幾乎接近于正常BALB/c小鼠水平，差異顯著，說明特異性siRNA長期作用下可提高機體免疫球蛋白含量，從而增加機體的體液免疫反應。

白細胞介素是在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，在傳遞信息，激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化，以及炎癥反應中起重要作用。IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T細胞產生，是具有廣泛生物活性的細胞因子，對T細胞的激活及生長有作用，是調控免疫應答的重要因子，也參與抗體反應、造血和腫瘤監視。IL-4是一種多功能細胞因子，主要由Th2細胞、肥大細胞及嗜堿性粒細胞產生，具有促進B細胞增殖、分化，誘導IgG1和IgE產生，促進Th0細胞向Th2細胞分化等作用。IL-6由Th2細胞分泌，它可誘導B細胞分化并產生免疫球蛋白，具有促進T細胞增殖生長、促進骨髓造血干細胞增殖、增強血細胞分化、抗瘤效應等。IFN-γ是一類分泌性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節功能，是Th1細胞分泌的特征性細胞因子，具有促進Th1細胞分化、上調Th1型免疫反應對病毒抑制與清除的作用。在乙肝病毒的清除過程中，機體主要通過IFN-γ介導非溶細胞途徑清除病毒［10］。IL-2和IFN-γ由Th1細胞分泌，通過促進CTL、NK細胞及巨噬細胞活化和增殖，介導細胞毒效應，在抗胞內病原體感染中發揮重要作用。IL-4和IL-6是Th2細胞分泌，其主要功能在于刺激B細胞增殖，參與體液免疫。當機體處于正常狀態時，Th1/Th2型細胞因子相互制約，處于動態平衡，維持正常的細胞免疫和體液免疫功能，任何一方的增多或減少都會使正常免疫調節失去平衡而引起免疫功能紊亂［11］。

T淋巴細胞亞群是參與機體免疫防御的重要細胞，CD4+和CD8+T淋巴細胞在機體細胞免疫中具有非常重要的作用。CD4+T淋巴細胞具有調節免疫反應活性、輔助B細胞產生抗體、分泌細胞因子的作用；而CD8+T淋巴細胞有免疫抑制和細胞毒性的作用。此2類細胞所占比例在一定程度上可以揭示機體的免疫狀態。在正常情況下，CD4+/CD8+T細胞比值應在一定范圍內并處于一種平衡狀態。實驗結果表明，特異性siRNA長期作用下可使HBV轉基因小鼠機體細胞免疫水平上調，外周血中的CD4+和CD8+T淋巴細胞增加，CD4+/CD8+T細胞比值升高，表現出一定的正向免疫調節作用，有利于機體抗病毒、抗腫瘤、抵抗宮內感染。

總之，慢性HBV感染由于持續存在的HBV cccDNA，單靠RNAi目前很難徹底清除病毒。因此，利用特異性siRNA長期作用機體，探討機體免疫反應，可為以后免疫疫苗提供應用時機。

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