絞股藍法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

蔣東，唐銀琳，陶晨陳，吳耀生

廣西醫科大學 生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021

萜類化合物是一類以異戊二烯為結構單元的天然烴類化合物，分布廣、種類多、結構多樣，是重要的植物初生代謝產物和次生代謝產物，在植物的生長發育、自身免疫和防御反應中起重要作用，同時也廣泛應用于工業、醫藥衛生等領域[1]。絞股藍、三七、羅漢果等中草藥的主要活性物質為萜類化合物。法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophaophate synthase，FPS，EC2.5.1.10）是一種異戊烯基轉移酶，是類異戊二烯途徑的一個關鍵酶，催化五碳原子的異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）以1-4頭尾連續縮合反應，形成15碳的法呢基焦磷酸（FPP）[2]，FPP是植物體內許多萜類物質合成的前體。目前已從羅漢果、三七、積雪草、青蒿等40多種植物中分離并克隆了FPS的cDNA序列。絞股藍以三萜皂苷為主要有效成分，研究其生物合成通路中的關鍵酶，是改變或調控其三萜皂苷合成通路，以提高有效成分含量和藥用價值的重要環節。

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum Thunb.Ma?kin）為葫蘆科絞股藍屬植物，又名遍地生根、公羅鍋底、七葉膽等，始載于《救荒本草》，《本草綱目》、《植物名實圖考》、《實用中草藥手冊》中均有記載。絞股藍全草入藥，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、護肝、增強免疫等作用[3]。目前對絞股藍的研究主要在有效成分的分離提取及其藥理作用方面。絞股藍三萜合成通路及相關酶的基因克隆、分子進化等方面也有一些報道，如絞股藍鯊烯合酶（SS）及鯊烯環氧酶（SE）[4]。絞股藍具有較強的生態適應性，自然分布于我國秦嶺和長江以南地區，廣西大部分地區都有分布，資源豐富。因此，對其進行系統研究，對我區絞股藍資源的合理利用和開發具有重要意義。

隨著蛋白質組學和轉錄組學等領域的興起，以mRNA為基礎的研究越來越受到關注，但mRNA在體外穩定性差，將其反轉錄為cDNA是一種有效的解決方法。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplifi?catiion of cDNA ends，RACE）是一種始于mRNA的3'或5'端，最終獲得目的基因全長cDNA的分子生物學技術[5]，已成功地應用于植物基因克隆研究。如蔣軍富等用RACE技術克隆到絞股藍SS及SE基因[4]，陳莉等用RACE技術從三七中克隆出FPS基因[6]，邢朝斌等通過RACE技術克隆出刺五加FPS基因[7]。RACE技術也可用來篩選cDNA文庫，魯國東等用RACE技術從已構建的cDNA文庫中克隆了稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因[8]。RACE技術還可用來分離調控元件或選擇性剪接等特殊轉錄物[9]。

本課題組前期采用RACE技術對絞股藍生物合成關鍵酶SS、SE基因進行了克隆和序列分析。為進一步研究絞股藍三萜皂苷生物合成途徑及其可能的分子調控機制，我們繼續應用RACE技術對絞股藍FPS基因進行克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

絞股藍采自荔浦縣，種植在廣西醫科大學校園；大腸桿菌DH5α感受態細胞、pMD18-T載體、LA Taq DNA聚合酶限制性內切酶、3'-Full RACE Core Set Ver 2.0和 5'-Full RACE 試劑盒等為 Ta?KaRa公司產品；柱式膠回收試劑盒及質粒小量提取試劑盒為中國福際公司產品；DNA寡核苷酸引物由華大基因公司合成；其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 絞股藍總RNA的提取

參照蔣軍富等的異硫氰酸胍法[4]。

1.3 3'RACE PCR 克隆

絞股藍與羅漢果均為葫蘆科植物，其三萜生物合成通路相關酶的基因應有較高的同源性。參照蒙姣榮[10]等有關羅漢果FPS基因的克隆及序列分析，設計擴增絞股藍FPS的3'RACE PCR引物FPSS-1F和FPSS-3F，由華大基因公司合成。

以絞股藍總RNA為模板，加入3'RACE Adap?tor，按試劑盒說明書反轉錄合成第一鏈cDNA。反應體系包括絞股藍總RNA 1 μL、3'RACE接頭1 μL、5×M-MLV緩沖液2 μL、dNTP 1 μL、RNase抑制劑 0.25 μL、反轉錄酶 M-MLV（RNase H-） 0.25 μL，用去除RNase的水補至總體積10 μL。42℃反轉錄60 min，70℃作用15 min，反應產物用于巢式PCR。以反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板，分別以FPSS-1F、FPSS-3F與3'RACE試劑盒中的3'RACE外引物、3'RACE內引物為引物，按照3'-Full RACE Core Set Ver 2.0說明進行3'RACE外側、內側2輪巢式PCR擴增反應。第1輪PCR反應條件為94℃預變性 3 min，然后以 94℃變性 30 s、55退火 30 s、72℃延伸1 min行20個循環，72℃延伸10 min。以第1輪PCR產物為模板進行第2輪巢式PCR。第2輪PCR反應條件為94℃預變性3 min，然后以94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行30個循環，72℃延伸10 min。用瓊脂糖電泳判斷PCR產物。內側PCR產物純化后，與pMD18-T連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，在X-gal/IPTG/Amp LB瓊脂平板上挑取白色菌落培養，提取質粒并進行酶切及PCR鑒定，將陽性克隆送華大基因公司測序。

1.4 5'RACE PCR克隆

根據絞股藍FPS的3'RACE測序結果，用專業引物設計軟件Primer Premier 5.0設計5'RACE克隆所需特異引物。

用5'-Full RACE試劑盒對絞股藍RNA進行去磷酸化處理、去“帽子”反應及5'RACE接頭的連接，得到Ligated RNA，以Ligated RNA反轉錄反應液為模板，分別以FPSS-2R、FPSS-4R與5'RACE試劑盒中的外引物、內引物為引物對進行2輪巢式PCR反應。第1輪PCR反應條件為94℃預變性3 min，然后以94℃變性30 s、55退火30 s、72℃延伸1 min行20個循環，72℃延伸10 min。以第1輪PCR產物為模板進行第2輪巢式PCR。第2輪PCR反應條件為94℃預變性3 min，然后以94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行 25個循環，72℃延伸 10 min。5'RACE內側PCR產物的純化及克隆參照3'RACE克隆操作進行。

1.5 絞股藍FPS基因cDNA全長序列的拼接及生物信息學分析

利用 Vector NTI Suite 6.0軟件對 3'RACE 和5'RACE所得片段的測序結果進行分析和拼接。利用DNAman軟件分析絞股藍FPS基因cDNA全長序列性質，序列測定結果采用Blast進行同源性搜索。用Mega5.0軟件對絞股藍和已報道的植物FPS氨基酸序列進行相似性比對，構建系統進化樹。

表1 擴增絞股藍FPS的RACE PCR引物

2 結果

2.1 3'RACE和5'RACE克隆絞股藍FPS基因

3'RACE和5'RACE分別得到約1000和750 bp的特異條帶，參見圖1。

3'RACE PCR產物重組質粒經SacⅠ/SphⅠ雙酶切，得到2.6 kb的載體片段和約1 kb的目的片段；5'RACE PCR產物重組質粒經酶切后得到約750 bp的目的片段和2.6 kb的載體片段。與預測結果相符，見圖2。

2.2 PCR產物測序

測序結果表明，3'RACE和5'RACE產物片段長度分別為985和714 bp（序列略）。

2.3 絞股藍FPS基因cDNA全長核苷酸序列分析

根據3'RACE和5'RACE擴增片段測序結果，用Vector NTI Suite 6.0軟件拼接得到絞股藍FPS基因全長序列。該基因全長1288 bp，翻譯起始位點為90堿基處，開放讀框編碼由342個氨基酸殘基構成的蛋白，其等電點為5.34，相對分子質量為3.94×104。

圖1 3′RACE（A）、5′RACE（B）PCR擴增FPS基因產物M：DL2000 DNA marker；1，2：3′RACE PCR產物；3，4：5′RACE PCR產物

圖2 SacⅠ/SphⅠ雙酶切重組質粒

氨基酸序列分析表明，絞股藍FPS的氨基酸序列中含有非極性疏水性氨基酸（GAVLIFP）40.6%，極性中性氨基酸（WSYCMNQT）35.0%，酸性氨基酸（DE）12.3%，堿性氨基酸（KRH）11.4%。

絞股藍的FPS基因cDNA及推衍的氨基酸序列如圖3。

2.4 不同植物FPS基因序列比較及進化樹分析

經NCBI Blast，發現絞股藍FPS的氨基酸序列與已知植物FPS的同源性為91%～74%，核酸序列同源性為88%～78%。用Mega5.0軟件將得到的絞股藍FPS與植物來源的FPS的氨基酸序列（表2）進行多重比對，構建得到進化樹（圖4）。

3 討論

圖3 絞股藍FPS cDNA序列及推導的氨基酸序列

RACE技術是獲得cDNA全長的有效方法，廣泛應用于全長基因cDNA的克隆。在RACE技術中，獲得基因3'端較容易，而采用TDT加尾法[11]獲得基因5'端則比較困難，往往需要根據實際情況摸索條件。我們采用TaKaRa公司的5'-Full RACE試劑盒，在對RNA進行去磷酸化、去“帽子”、加5'RACE接頭后直接進行逆轉錄，然后進行巢式PCR，可以得到很好的5'RACE結果。但操作時間長，對RNA的完整性和穩定性要求高，因此保證RNA的質量和操作環境的清潔非常重要。

圖4 不同植物FPS氨基酸序列進化樹

本研究克隆的絞股藍FPS基因與已報道的其他植物的FPS基因的編碼區基本一致，FPS有2個富含天冬氨酸（DDXXDD）的氨基酸序列保守區域［LIVM］［LIVM］XDDXXDXXXXRRG 和［LIVMFY］GXXFQ［LIVM］XDD［LIVMFY］X［DN］[7,12-13]，推測的絞股藍 FPS肽鏈 90～104殘基（LVLDDIMDSSH?TRRG）和224～236殘基（MGTYFQVQDDYLD）與此完全相符。絞股藍FPS的跨膜區分析和亞細胞定位顯示其無跨膜結構，定位于細胞質中，這與其他植物FPS在細胞質中合成前體蛋白后不進入其他亞細胞器，而是留在細胞質中經翻譯后蛋白質的加工成為成熟蛋白質發揮催化作用而不與膜脂結合[1,13]的觀點相一致。進化樹分析表明絞股藍FPS與羅漢果、黃瓜的親緣關系最近，這證實了葫蘆科植物FPS基因的同源性，與預期結果相符。同時還發現絞股藍、羅漢果、黃瓜與蘋果FPS的親緣關系也較近，但根據NCBI采納的植物分類表，葫蘆科屬于葫蘆目，蘋果則屬于薔薇目薔薇科，進化上葫蘆科植物與薔薇科處于不同的分支，有可能是一個FPS基因進化的分支點。

目前利用酶表達改變萜類物質組成或量已成為改變作物及中草藥植物品質的一種新手段[14]。在轉基因青蒿中過量表達青蒿的FPS基因，轉基因株系中青蒿素量有所提高[15]。也有研究表明，這一技術可提高在轉化薄荷FPS基因的烤煙中類胡蘿卜素及萜烯類香氣物質的量，對提高煙葉香氣品質具有促進作用[16]。綜上，我們在前人的基礎上克隆了絞股藍FPS基因，并對其編碼的氨基酸進行了理化性質、結構組成及生物信息學分析，以期為絞股藍FPS的表達研究及三萜皂苷合成通路分子進化奠定基礎。目前絞股藍FPS的表達研究正在進行中。

[1] 李嶸,王喆之.植物法呢基焦磷酸合成酶的生物信息學分析[J].熱帶亞熱帶植物學報,2007,15(2):126-134.

[2] Cornish K.The separate roles of plant cis and trans prenyl transferases in cis-1,4-polyisoprene biosynthsis[J].Eur J Bio?chem,1993,218:267-271.

[3] 張云峰,魏東,鄧雁如,等.三萜皂苷的生物活性研究新進展[J].中成藥,2006,28(9):1349-1353.

[4] 蔣軍富,李雄英,吳耀生,等.絞股藍鯊烯環氧酶基因的克隆與序列分析[J].西北植物學報,2010,30(8):1520-1526.

[5] Scotto-Lavino E,Du G,Frohman M A.Amplification of 5'end cDNA with‘new RACE’[J].Nat Protoc,2006,1(6):3056-3061.

[6] 陳莉,藍秀萬,李珅,等.三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析[J].中草藥,2006,37(7):1080-1083.

[7] 邢朝斌,龍月紅,何閃,等.刺五加法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、生物信息學及表達分析[J].中國中藥雜志,2012,37(12):1725-1729.

[8] 魯國東,王宗華,鄭學勤,等.cDNA文庫和PCR技術相結合的方法克隆目的基因[J].農業生物技術學報,1998,6(3):257-261.

[9] Klein M,Pleri I,Uhlmann F,et al.Cloning and characteriza?tion of promoter and 5'-URT of the NMDA receptor subunit2:evidence foralternative splicing of5'-non-coding exon[J].Gene,1998,208(2):259-269.

[10]蒙姣榮,陳本勇,黎起秦,等.羅漢果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析[J].中草藥,2011,42(12):2512-2517.

表2 用于進化分析的植物來源的FPS序列信息

[11]陳啟龍.RACE技術的研究進展及其應用[J].黃山學院學報,2006,8(3):95-98.

[12]谷巍,吳啟南,巢建國,等.建澤瀉法呢基焦磷酸合酶分子克隆、分布表達及生物信息學研究[J].藥學學報,2011,46(5):605.

[13]Cane D E,Xue Q,Fitzsimons B C.Trichodiene synthase.probing the role of the highly conserved aspartate-rich region by sitedirected mutagenesis[J].Biochemistry,1996,35(38):12369-12376.

[14]任彥,盧鋼,曹家樹,等.利用類萜代謝工程改良作物風味[J].細胞生物學雜志,2005,27:319-324.

[15]Banyai W,Kirdmanee C,Mii M,et al.Overexpression of Farnesyl pyrophosphate synthase（FPS） gene affected artemis?inin content and growth of Artemisia annua L.[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2010,103:255-265.

[16]李雪君,崔紅,劉海礁,等.FPS轉基因烤煙類胡蘿卜素及其降解產物的研究[J].中國煙草科學,2006,27(3):25-27.