中東呼吸綜合征冠狀病毒假病毒系統的建立及其在中和抗體檢測中的應用

李琳，郭彥，趙光宇，于虹，孫世惠，潘婷，唐健，周育森，樊衛平

1.山西醫科大學 微生物與免疫學教研室，山西 太原 030001；2.軍事醫學科學院 微生物流行病研究所，病原生物學國家重點實驗室，北京 100071

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respira?tory syndrome coronavirus，MERS-CoV）是一種新型冠狀病毒[1]，它可以使感染者出現急性、嚴重呼吸道疾病，伴有發熱、咳嗽、氣短及呼吸困難，部分病例出現腎功能衰竭和死亡[2-3]，是一種高致病性病毒。活病毒中和試驗一直是檢測血清抗體中和活性、評價抗體抗病毒作用的重要方法。但高致病性病毒的活病毒中和試驗需要高等級生物安全實驗條件，對實驗條件和人員素質提出了更高的要求，增加了實驗實施的難度和成本。為了克服MERS-CoV活病毒感染和中和試驗在安全、效率等方面存在的諸多困難和不便，我們建立了一種MERS假病毒系統，并應用于抗體中和活性檢測的中和試驗。為MERS-CoV疫苗與抗體評價及病毒致病機制研究提供一種安全、有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細胞、Huh-7細胞和COS-7細胞均由本室保存；大腸桿菌DH5α感受態細胞、質粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自北京全式金公司；MERS-CoV S基因（GenBank：JX869059.2）由生工生物工程（上海）有限公司合成，合成基因的上游帶有BamHⅠ酶切位點，下游順序含有終止密碼子和XhoⅠ酶切位點；缺少Env基因而表達螢光素酶的人類免疫缺陷病毒（HIV）骨架質粒pNL4-3.Luc.RE、表達水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白的重組表達質粒pVSV-G 和載體質粒 pcDNA3.1 由本室保存[4]；DNA連接酶購自TaKaRa公司；質粒去內毒素大量提取試劑盒購自天根公司；轉染試劑TurboFect、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自Thermo公司；細胞培養器材購自CORNING公司；DMEM細胞培養基、OMEM細胞培養基、胎牛血清、胰酶和青霉素鏈霉素抗生素均購自GIBCO公司；兔抗HIV-1 P24多抗和兔抗MERS-CoV S1多抗購自北京義翹神州生物技術有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自上海優寧維生物技術公司；螢光素酶底物購自Promega公司；對MERS-CoV具有中和活性的MERS-CoV受體結合區特異性小鼠血清、H5N1禽流感病毒HA抗原特異性小鼠血清和正常小鼠血清均經過受體破壞酶（RDE）處理和56℃、30 min補體滅活，由本室制備和保存[5-6]。

1.2 pMERS-S的質粒構建及擴增

載體質粒pcDNA3.1經BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后與經相同酶切后回收的MERS-CoV S基因片段連接，構成重組質粒pMERS-S，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經氨芐西林抗性篩選陽性克隆擴大培養，用去內毒素質粒大量提取試劑盒提取質粒備用。

1.3 假病毒的制備

將 pMERS-S 和 pNL4-3.Luc.RE 兩種質粒各 20 μg逐滴加入4 mL OMEM培養基中，輕輕振蕩后再逐滴加入80 μL TurboFect轉染試劑，輕輕彈動管壁后室溫靜置15 min，將質粒與轉染試劑的混合物逐滴加入293T細胞中，37℃、5%CO2培養6 h后將培養液棄去，換成新鮮DMEM培養基繼續培養，72 h后收獲含MERS假病毒（pMERS-S）的上清，6000 r/min離心15 min去除細胞碎片后將上清分裝，-80℃保存。用同樣方法，分別利用pVSV-G和pcDNA3.1質粒制備作為陽性對照和陰性對照的VSV假病毒（pVSV-G）和pcDNA3.1假病毒（pEnv-）。

1.4 Western印跡

將制備的含假病毒的培養上清用PEG6000濃縮至1/50后加入上樣緩沖液，100℃處理10 min，進行SDS-PAGE（分別采用8%和12%SDS-PAGE檢測假病毒中MERS-CoV S抗原和HIV-1 P24抗原的表達），電泳后按常規方法轉膜（200 mA，150 min），轉膜完成后，用脫脂牛奶（5 g/mL）常溫封閉4 h，進行Western印跡，一抗為1 μg/mL兔抗MERS-CoV S1抗原或兔抗HIV-1 P24多抗，二抗為1∶5000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG抗體，ECL化學發光法觀察結果。

1.5 MERS假病毒的感染力測定

將4×105/mL的Huh-7細胞接種于96孔細胞培養板，100 μL/孔，37℃、5%CO2培養16 h，使細胞長成單層；加入梯度稀釋的MERS假病毒，100 μL/孔，每個稀釋度設置復孔；設置未加假病毒的空細胞對照，分別以VSV假病毒和pcDNA3.1假病毒作為陽性和陰性對照；37℃、5%CO2培養24 h后更換為新鮮培養基繼續培養48 h，檢測螢光素酶活性（相對光單位，RLU），以此反映MERS假病毒的感染力。

1.6 MERS假病毒中和試驗

將4×105/mL Huh-7細胞接種于96孔細胞培養板，100 μL/孔，37℃、5%CO2培養16 h，使細胞長成單層；將血清從1∶40開始梯度稀釋后與等體積的MERS假病毒（RLU=40000）混合，設置復孔，于37℃、5%CO2放置1 h；之后將血清-假病毒混合液接種于單層Huh-7細胞，同時設置未與血清混合的假病毒對照和只加培養基的空細胞對照，37℃、5%CO2培養24 h后更換為新鮮培養基繼續培養48 h；檢測螢光素酶活性（RLU），按照下式計算血清抗體中和百分率（%）：

1.7 統計分析

利用GraphPad Prism軟件，對MERS假病毒感染細胞的RLU值與假病毒量的相關性進行Pearson相關分析，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 MERS假病毒（pMERS-S）的制備與鑒定

用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切重組質粒pcDNA3.1-MERS-S，獲得了與載體（5372 bp）和MERS-CoV S基因（4068 bp）大小相符的2條DNA條帶（圖1）。DNA測序進一步證實重組質粒pcDNA3.1-MERS-S中正確插入了MERS-CoV S基因。將pcDNA3.1-MERS-S與假病毒包裝骨架質粒pNL4-3.Luc.RE共轉染293T細胞，制備攜帶MERS-CoV S蛋白的假病毒（pMERS-S）。同時，分別以pVSV-G和pEnv-作為陽性和陰性對照。Western印跡檢測結果表明，用HIV-1 P24抗體檢測時，pMERS-S、pVSV-G 和pEnv-三種假病毒在相對分子質量25×103處均有條帶，與預期大小相符（圖2），表明利用HIV骨架質粒（pNL4-3.Luc.RE）成功包裝出假病毒。當用MERSCoV S1特異性抗體檢測時，只有pMERS-S在相對分子質量約180×103位置出現與預期大小相符的條帶（圖2），表明假病毒pMERS-S表達MERS-CoV S蛋白。

圖1 重組質粒pcDNA3.1-MERS-S的酶切鑒定1：重組質粒pcDNA3.1-MERS-S經BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切；M：Trans 15k DNA marker

2.2 MERS假病毒（pMERS-S）的感染力測定

為了明確包裝出的MERS假病毒能否感染含有MERS-CoV受體（二肽基肽酶4，DPP4）的細胞，用pMERS-S分別感染表達DPP4的Huh-7細胞和不表達DPP4的COS-7細胞。結果表明，pMERS-S對Huh-7細胞具有感染力，且假病毒的量與感染力呈量效關系（P＜0.01，Pearson相關分析），隨著pMERSS稀釋度的增加，假病毒感染Huh-7細胞的RLU值逐漸下降。pMERS-S感染的COS-7細胞只檢測出本底水平的熒光值。VSV對于Huh-7和COS-7細胞都具有感染力，而pVSV-G感染的這兩種細胞均可檢測出高水平熒光值。pEnv-因缺少跨膜蛋白而不感染Huh-7和COS-7細胞，只檢測到本底水平的熒光值。見圖3。

2.3 MERS假病毒中和試驗

為了驗證制備的MERS假病毒能否通過中和試驗進行抗體中和活性的檢測，利用已知對MERSCoV具有中和活性的小鼠血清進行假病毒中和試驗，同時以正常小鼠血清和重組H5N1 HA抗原免疫小鼠血清為陰性對照。結果表明，對MERS-CoV具有中和活性的血清通過MERS假病毒中和試驗同樣檢測出中和活性，并且隨著血清稀釋度的增加，其對MERS假病毒的中和作用逐漸下降，而2種陰性對照血清對MERS假病毒并無中和作用（圖4）。表明制備的pMERS-S可用于假病毒中和試驗來檢測血清抗體的中和活性。

圖2 假病毒的Western印跡1：pEnv-；2：pMERS-S；3：pVSV-G；M：蛋白marker

圖3 假病毒對不同細胞系的感染力

圖4 假病毒中和試驗檢測結果

3 討論

MERS-CoV是繼SARS-CoV之后出現的又一種對人類具有高致病性的冠狀病毒[7]。截至2013年7月，已累計感染70人，病死率為55.7%[8]。由于該病毒對人類的致病性強、病死率高，并且已出現了有限的人際傳播感染[9]，因此，預防與治療手段的研究對于防控MERS疫情具有重要意義，而用于預防與治療效果評價的技術和手段具有重要的支撐作用。中和試驗一直是評價抗體抗病毒作用的重要方法，但利用MERS-CoV的活病毒開展中和試驗需要生物安全3級實驗室（BSL-3），并且對實驗人員的生物安全操作素質要求很高。這無疑增加了試驗的風險和成本。MERS假病毒顆粒由于只具有一次感染能力而無復制能力，應用于血清中和抗體的檢測并不需要BSL-3的實驗條件，極大地降低了實驗操作的風險，提高了效率。

假病毒體系的構建主要包括以反轉錄病毒載體和以慢病毒載體為基礎的2種方式，目前最常用的是以慢病毒載體為基礎的假病毒構建體系。我們利用 HIV-1 骨架質粒 pNL4-3.Luc.RE，通過與攜帶MERS-CoV S基因的質粒共轉染細胞，獲得只具有一次感染能力而無復制能力的MERS-CoV假病毒顆粒。由于pNL4-3.Luc.RE骨架質粒中HIV-1基因缺乏Env基因，假病毒的包膜蛋白需要由另一質粒上的MERS-CoV S基因表達來提供，因此，MERS假病毒顆粒的感染性受其S蛋白識別受體的限制。本研究制備的MERS假病毒能很好地感染含MERS-CoV受體的Huh-7細胞，但對于無DPP4表達的COS-7細胞就不具有感染性，而目前已知MERS-CoV正是利用DPP4作為它進入宿主細胞的受體[10]。在假病毒中和試驗中，MERS假病毒能被中和抗體有效中和而失去對宿主細胞的感染作用。本研究使用的中和抗體不僅具有活病毒中和試驗證實的中和活性，而且已知對MERS-CoV S蛋白受體結合區具有特異性。這進一步說明，MERS假病毒顆粒所攜帶的S包膜蛋白與MERS-CoV S蛋白一樣具有介導病毒感染的作用。而這種病毒受體識別特性，使MERS假病毒不僅可用于疫苗誘導中和抗體能力和抗體抗病毒效果的評價，也可用于病毒受體相關致病機制的研究。因此，本研究建立的MERS假病毒系統是一種對MERS-CoV疫苗、藥物及致病機制研究具有良好支撐作用的技術手段。

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