含p53保守結(jié)合位點的microRNA表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用

秦性良，蘇雪婷，丁紅梅，黃皚雪，李慧，侯綠濱，葛興楓，李潔，邵寧生

1.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021；2.軍事醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京 100850

經(jīng)過數(shù)十年深入研究，人們發(fā)現(xiàn)p53在多種腫瘤應(yīng)激相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[1-2]。p53作為一種能夠與DNA結(jié)合的特異轉(zhuǎn)錄因子，在DNA損傷、藥物作用、原癌基因激活等多種應(yīng)激信號下被活化，進而調(diào)控下游靶基因，參與DNA損傷修復、細胞周期調(diào)節(jié)等一系列重要生命過程[3]。p53特異性DNA結(jié)合位點通常由2條長度約10 bp的序列組成，序列模式為5'-RRRCWWGYYY（N）RRRCWW?GYYY-3'（R=A或G，W=A或T，Y=C或T），2個拷貝間由0～13個隨機堿基隔開（N=0～13 nt）。

microRNA（miRNA）是一類長約19～25 nt的單鏈非編碼小RNA，在進化過程中高度保守。這類內(nèi)源性非編碼小RNA分子主要通過與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合，導致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控基因表達[4-6]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA調(diào)控靶基因通路與p53信號通路相互交叉并相互影響。2006年，Voorhoeve等通過遺傳學手段篩選人miRNA，首次發(fā)現(xiàn)miRNA參與p53信號通路[7]。隨后Xi等分析HCT-116細胞系表達譜發(fā)現(xiàn)，表達水平存在顯著差異的326條miRNA中，46%的miRNA在其上游5 kb預(yù)測啟動子區(qū)內(nèi)含有p53結(jié)合位點，這一發(fā)現(xiàn)表明p53調(diào)控miRNA表達的可能性[8]。隨后，有5個相互獨立的研究小組相繼報道了miR-34家族與p53的相互作用，揭開了miRNA參與p53信號通路、p53調(diào)控miRNA生物合成的相互作用關(guān)系。隨后越來越多能夠參與p53信號通路的miRNA被發(fā)現(xiàn)，如miR-34家族（miR-34a，miR-34b，miR-34c）、miR-29家族（miR-29a，miR-29b，miR-29c）、miR-125b、miR-145、miR-192、miR-215、miR-194 和miR-21l等[9-10]。

基于上述研究基礎(chǔ)，我們利用p53的轉(zhuǎn)錄激活活性，構(gòu)建含有p53保守結(jié)合位點的高效miRNA表達載體，希望實現(xiàn)在表達野生型p53的細胞中對靶標進行有效調(diào)控。本研究選用3條人源miRNA，即miR-138、miR-34a和miR-21及其各自對應(yīng)的已有文獻報道的靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN[11-13]來證實這一方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌H1299細胞和人宮頸癌上皮細胞HeLa由本實驗室保存；miRNA表達載體pCMV-miR購自O(shè)riGENE公司；p53真核表達載體購自義翹神州公司；siRNA由上海吉瑪公司合成。

DMEM和1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；TRIzol和LipofectAMINE2000購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶AscⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ，M-MLV反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR系統(tǒng)，質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；pfu高保真酶、dNTP及相關(guān)緩沖液購自天根公司；其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；所有引物及其他DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 載體構(gòu)建

分別合成3條具有p53保守結(jié)合位點的DNA序列，用BamHⅠ和AscⅠ雙酶切pCMV-miR載體和p53結(jié)合位點序列，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆測序鑒定（由中美泰和生物公司完成），將所獲陽性克隆質(zhì)粒命名為pCMV/p53-miR。

以H1299細胞基因組為模板，PCR擴增miR-138、miR-34a、miR-21 前體序列，分別得到 135、146、108 bp的DNA片段，經(jīng)12%PAGE，乙醇沉淀法切膠回收純化，將回收的DNA片段用XhoⅠ和EcoRⅤ雙酶切后構(gòu)建到pCMV-miR和pCMV/p53-miR載體中，分別命名為pCMV-miR-138、pCMV/p53-miR-138、pCMV-miR-34a、pCMV/p53-miR-34a、pCMV-miR-21和pCMV/p53-miR-21。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)H1299細胞，采用胰酶消化法進行細胞傳代。將生長狀態(tài)良好的HeLa或H1299細胞接種于24孔板中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，將質(zhì)粒DNA、Lipo?fectAMINE2000按照說明書的比例分別稀釋于50 μL無血清培養(yǎng)基中，然后將兩者輕輕混合，室溫放置20 min，用無血清培養(yǎng)基洗24孔板細胞2次，加入400 μL無血清培養(yǎng)基后，將質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合物輕輕加入24孔板細胞，混勻，培養(yǎng)4 h，更換為含血清的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收取細胞進行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染實驗用500 ng質(zhì)粒、20 nmol/L p53 siRNA（AAGACUCCAGUGGUAAUCUACdTdT）。

1.4 RNA的提取及其完整性、濃度鑒定

用TRIzol試劑提取細胞總RNA，將提取的RNA稀釋至1/50，在紫外分光光度計上檢測RNA濃度及D260nm/D280nm值，取1 μg RNA用1%瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

1.5.1 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 取1 μg 細胞總RNA樣品，加入1 μL oligo（dT），用DEPC水補足至11 μL，70℃變性5 min后立即置冰上退火，之后加入如下試劑的混合物［5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，dNTP（25 mmol/L）2 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，RNase抑制劑 0.5 μL］，組成 20 μL 的反應(yīng)體系，42℃反應(yīng)90 min后95℃處理10 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

取1 μg細胞總RNA樣品加尾，25 μL反應(yīng)體系包括 QmiR-RT（GCGAGCACAGAATTAATACGACT?CACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN）（500ng/μL）1 μL、10×大腸桿菌 poly（A）聚合酶緩沖液 2.5 μL、2.5 mmol/L MnCl22.5 μL、dNTP（25 mmol/L）2.5 μL、100 mmol/L ATP 2.5 μL、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、大腸桿菌poly（A）聚合酶1 μL、RNase抑制劑0.5 μL，37℃反應(yīng)90 min后95℃處理10 min以滅活酶，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 實時熒光定量PCR 用安捷倫公司的Strata?gene MX3000P熒光定量PCR儀和SYBR Green PCR MasterMix對miR-138、miR-34a、miR-21及其各自靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA水平進行檢測，特異性引物序列見表1。采用MX3000P軟件進行分析。

1.6 Western印跡檢測

轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，加入適量RIPA裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，1%NP-40，1%去氧膽酸鈉，1 mmol/L EDTA，0.1%SDS，0.2 mmol/L PMSF，1 μg/mL蛋白酶抑制劑］于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，用12%SDSPAGE分離蛋白；轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用1×TBST配制5%的脫脂奶粉封閉1 h，根據(jù)一抗說明書稀釋一抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗4次，每次10 min，室溫孵育山羊抗兔帶HRP標記的IgG（1∶8000稀釋），洗膜5次，每次10 min，用增強發(fā)光液在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中發(fā)光顯色。

表1 實時熒光定量PCR中的引物序列

2 結(jié)果

2.1 含有p53保守結(jié)合位點的miRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建

通過生物信息學網(wǎng)站TP53 database數(shù)據(jù)庫（http://p53.iarc.fr/）選取 3 條經(jīng)典的 p53保守結(jié)合位點序列（圖1）。

圖1 p53保守結(jié)合位點生物信息學分析

將合成的帶有酶切位點的p53結(jié)合位點序列經(jīng)BamHⅠ和AscⅠ酶切處理，插入pCMV-miR載體，命名為pCMV/p53-miR；以H1299細胞基因組為模板，通過 PCR獲得miR-138、miR-34a、miR-21前體序列，得到135、146、108 bp的DNA片段（圖2）；將擴增的片段經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅤ雙酶切后插入pCMV/p53-miR質(zhì)粒，命名為pCMV/p53-miRNA。

圖2 天然膠PAGE鑒定miR-138、miR-34a和miR-21前體序列M：pUC18 marker；1：miR-138；2：miR-34a；3：miR-21

以pCMV-miR載體為對照，將改構(gòu)的miRNA表達載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞48 h后，用qRT-PCR檢測miR-138、miR-34a和miR-21的表達量，結(jié)果見圖3。相對于商業(yè)化的pCMV-miR載體，pCMV/p53C-miRNA表達載體能夠更加高效地表達miR-138、miR-34a和miR-21。

圖3 HeLa細胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表達水平（**P＜0.01）

2.2 利用pCMV/p53C-miRNA載體檢測miR-138、miR-34a和miR-21對其各自靶基因的調(diào)控

2.2.1 HeLa細胞中miR-138、miR-34a和miR-21對各自靶基因的調(diào)控 在具有野生型p53的HeLa細胞中，我們選取了pCMV/p53C-miRNA與商業(yè)化的pCMV-miR載體來比較miR-138、miR-34a和miR-21對各自靶基因的調(diào)控作用效果。結(jié)果顯示，向HeLa細胞中轉(zhuǎn)染pCMV/p53C-miR-138、pCMV/p53C-miR34a、pCMV/p53C-miR21后，Cyclin D3、CDK2、PTEN無論在mRNA水平還是蛋白水平的下調(diào)都最為明顯（圖4）。

用siRNA沉默HeLa細胞中的p53基因，靶基因Cyclin D3、CDK2、PTEN的表達量下調(diào)無明顯變化（圖5），提示pCMV/p53C-miRNA表達載體在野生型p53存在的條件下才能更好地促進miRNA表達。

2.2.2 H1299細胞中miR-138、miR-34a、miR-21對各自靶基因的作用效應(yīng)檢測 在不表達p53的H1299細胞中，同樣用pCMV/p53C-miRNA與商業(yè)化的pCMV-miR載體比較了miR-138、miR-34a和miR-21對各自靶基因的作用效果。向H1299細胞中轉(zhuǎn)染 pCMV/p53C-miR138、pCMV/p53C-miR34a、pCMV/p53C-miR21后，Cyclin D3、CDK2、PTEN無論在mRNA水平還是蛋白水平的下調(diào)程度都與商業(yè)化miRNA表達載體無明顯差別；而在H1299細胞中將改構(gòu)的miRNA表達載體與p53真核表達載體共轉(zhuǎn)染后，靶基因Cyclin D3、CDK2、PTEN無論在mRNA水平還是蛋白水平的下調(diào)都更為明顯（圖6）。

圖4 HeLa細胞中過表達miR-138、miR-34a和miR-21后對靶基因的作用A：實時熒光定量PCR檢測HeLa細胞中用miRNA表達載體過表達miR-138、miR-34a和miR-21后各自對應(yīng)靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA表達水平，*P＜0.05；B：Western印跡檢測HeLa細胞中用miRNA表達載體過表達miR-138、miR-34a和miR-21后各自對應(yīng)靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的蛋白表達水平

3 討論

圖5 敲低HeLa細胞中p53的表達后過表達miR-138、miR-34a和miR-21對靶基因表達水平的影響A：實時熒光定量PCR檢測用siRNA沉默p53的mRNA表達水平；B：Western印跡檢測用siRNA沉默p53的蛋白表達水平；C：實時熒光定量PCR檢測過表達miR-138、miR-34a和miR-21后各自對應(yīng)靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA表達水平；D：實時熒光定量PCR檢測過表達miR-138、miR-34a和miR-21后的miRNA表達水平；E：Western印跡檢測過表達miR-138、miR-34a和miR-21后Cyclin D3、CDK2、PTEN的蛋白表達水平

從最初發(fā)現(xiàn)miR-34家族作為p53的直接調(diào)控因子以來[12,14-15]，miRNA參與的p53信號通路便得到研究者的廣泛關(guān)注。在miRNA參與的p53信號通路中，p53可以上調(diào)miRNA的表達。為了驗證表達野生型p53的細胞中，p53是否可促進miRNA表達，我們將p53保守結(jié)合位點構(gòu)建到miRNA表達載體中，希望借此進一步探討p53與miRNA的調(diào)控關(guān)系。

圖6 H1299細胞中miR-138、miR-34a和miR-21對靶基因的作用

在表達野生型p53的HeLa細胞中轉(zhuǎn)染帶有p53結(jié)合位點的miRNA表達載體后，能夠有效上調(diào)miR-138、miR-34a和miR-21的表達。在p53缺失型的H1299細胞中，轉(zhuǎn)染帶有或不帶有p53結(jié)合位點的miRNA表達載體，miR-138、miR-34a和miR-21的表達量并無明顯變化；將p53真核表達載體與帶有p53結(jié)合位點的miRNA表達載體共轉(zhuǎn)染H1299細胞，則能極大地促進miR-138、miR-34a和miR-21的表達。我們同時選用已有文獻報道的miR-138、miR-34a和 miR-21靶基因 Cyclin D3、CDK2和PTEN，檢測所構(gòu)建的載體是否能夠有效發(fā)揮基因調(diào)控功能，發(fā)現(xiàn)Cyclin D3、CDK2和PTEN的蛋白表達水平與mRNA水平結(jié)果是一致的。

綜上所述，我們構(gòu)建了含有p53結(jié)合位點的miRNA表達載體，并通過miR-138、miR-34a、miR-21及其靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN進行了實驗驗證，證實轉(zhuǎn)染含有p53結(jié)合位點的miRNA表達載體后，與商業(yè)化miRNA表達載體相比，在表達野生型p53的HeLa細胞中可以提高miRNA的表達效率，而在p53缺失型H1299細胞中我們的改構(gòu)載體與商業(yè)化載體的表達效率沒有明顯差異。這表明在表達野生型p53的細胞中，利用我們構(gòu)建的載體可以更高效地促進miRNA及其對相應(yīng)靶基因的調(diào)控。同時，我們可以利用該載體來初步驗證細胞是否具有p53轉(zhuǎn)錄活性，這對研究p53-miRNA信號通路具有重要意義。

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