漢坦病毒S基因的克隆及體外轉錄

郝麗娜，胡丹，呂恒，張錦海，張鳳玉，龔秀芳，

李丙軍2，朱進2，潘秀珍 2，姚蘋蘋3，張云2，王長軍1，2，陳建華1

1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.南京軍區 軍事醫學研究所，江蘇 南京 210002；

3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310051

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，在我國漢坦病毒主要引起腎綜合征出血熱，臨床上以發熱、出血和腎損害為主要特征，流行病原主要以漢灘型（HTN）76118株和漢城型（SEO）R22株為主[1-2]。

漢坦病毒是單股負鏈RNA病毒，其基因組由大（L）、中（M）、小（S）3個片段組成，分別編碼病毒RNA聚合酶、膜蛋白G1和G2及核衣殼蛋白（NP）[3]。病毒表面的糖蛋白G1和G2是型特異性抗原，可刺激機體產生中和抗體。NP是主要群特異性抗原，比病毒編碼的其他蛋白易于表達且有更好的免疫原性，可刺激機體產生補體結合抗體，在急性感染期NP抗體即可達到很高的滴度，故常作為診斷用抗原[4]。

我們將HTN型和SEO型病毒編碼NP的S基因克隆至含雙啟動子的PCRⅡ載體，進行體外轉錄，獲得含目的基因序列的RNA轉錄體，并經一步法熒光定量PCR檢測[5]，得到可用于漢坦病毒檢測的陽性標準品。本研究可為基層快速檢測漢坦病毒方法的建立和改進提供陽性定量標準品，對漢坦病毒致病機制、基因組功能、疫苗構建等研究也有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1～5 d齡的乳沙鼠購自軍事醫學科學院；漢坦病毒HTN型76118株及SEO型R22株為本實驗室保存；載體PCRⅡ-T Vector購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、Ribopmbe System-T7體外轉錄試劑盒購自Promega公司；SpeⅠ、SacⅠ內切酶、T4DNA聚合酶、250 bp DNA marker、質粒提取試劑盒、Prime?Script RT Master Mix反轉錄試劑盒、DNA純化試劑盒、One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒購自TaKa?Ra公司；RNA純化試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 引物合成

根據GenBank中76118株和R22株的S基因序列設計擴增引物，由上海賽百盛公司合成。引物HTN1P（5'-ATGCATGCGGCCGCTACCATGGCAAC TATGGAGG-3'）和 HTN2P（5'-GATCGTCGACTTA GATCTAGAGTTTCAAAGGCTC-3'）用于擴增 76118株S基因（1290 bp），引物SEO1P（5'-GGAATTCCG AAAAATGGCAACTATGGAAGAAA-3'）和 SEO2P（5'-GCTGCAGCACCCGTGATTATACATAGCAGTGA-3'）用于擴增R22株S基因（1558 bp）。

1.3 提取RNA

將2株病毒接種1～5 d齡乳沙鼠，每只腦內接入0.02 mL，15 d左右收獲發病小鼠，無菌取腦，研磨腦組織，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，1%瓊脂糖電泳及分光光度計（Onedrop 1000）檢測RNA純度及濃度，保存備用。

1.4 目的基因的擴增及重組質粒的構建

將病毒RNA反轉錄合成cDNA，用上、下游引物擴增目的片段。反應體系包括10×PCR緩沖液2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，Taq酶（25 U/μL）0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 16.3 μL，共 25 μL。反應條件：95℃ 5 min，然后以 95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 2 min循環30次，72℃延伸10 min。將擴增產物送Invitrogen公司進行T7克隆，并測序。

1.5 測序結果比對

將測序結果與GenBank中的相應序列用DNA?Star的MegAlign和NCBI上的BLAST在線比對。

1.6 重組質粒的線性化及濃度測定

為了獲得確定長度的含插入基因全長序列的轉錄產物，須將質粒線性化。76118、R22株重組質粒分別用SpeⅠ、SacⅠ內切酶于37℃消化3 h，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察線性化結果。用SacⅠ內切酶線性化的R22株PCRⅡ質粒3'端突出，用T4DNA聚合酶修復，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化。用分光光度計測定線性化質粒含量。

1.7 體外轉錄及模板RNA標準品的制備

根據Riboprobe System-T7試劑盒說明進行體外轉錄。室溫配制反應體系［5×磷酸鹽緩沖液4 μL，二硫蘇糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μL，核酸酶抑制劑（RNasin，40 U）1 μL，核糖核苷三磷酸（rNTP，終濃度各為 0.5 mmol/L）4 μL，線 性 化質粒 6 μL，T7RNA聚合酶（18 U）1 μL，無核酸酶的水2 μL，共20 μL］，37℃反應1 h；轉錄產物加1.5 μL脫氧核糖核酸酶（RQ 1 RNase Free DNase，1 U/μL），37℃繼續反應20 min，除去DNA模板；然后用RNA純化試劑盒純化轉錄產物并用分光光度計測定含量。將已測濃度的體外轉錄RNA產物溶液濃度換算成拷貝/μL。拷貝數=濃度×阿伏伽德羅常數/（1個堿基對的平均分子質量×總長度），其中阿伏伽德羅常數為6.02×1023。

1.8 RT-PCR法鑒定體外轉錄RNA

將cRNA梯度稀釋至1×1010～1×102拷貝/μL，以各稀釋液為模板進行RT-PCR。漢坦病毒通用引物為 HANTAV1U（5'-CWGGVCARACAGCWGAYT-3'）和 HANTAV1L（5'-TCCWGGTGTAADYTCHTCWG C-3'）；探針為 HTN1P（5'-Fam-AGCATCATCGTCT ATCTTACATCC-Tamra-3'）和 SEO1P（5'-Fam-CTA TAATTGTCTATCTAACATCA-Tamra-3'）[5]。反應體系包括2×One Step RT-PCR緩沖液10 μL，Ex taq HS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix 0.4 μL，上 、下 游 引 物 各 0.4 μL，探 針 0.8 μL，ddH2O 5.6 μL，RNA 2 μL。 反 應 程 序 ：42℃ 5 min，95℃ 5 s；95℃ 15 s，52℃ 30 s，循環45次。

2 結果

2.1 76118、R22株S基因的擴增與重組質粒的確認

以反轉錄的cDNA為模板的擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，目的片段分別約為1.3和1.6 kb，與預期結果相符。以重組質粒為模板也擴增出相應大小的目的片段，表明獲得了全長目的片段，且被克隆到PCRⅡ載體（圖1）。

2.2 測序結果比對

將測序結果與GenBank中76118和R22株的S基因序列進行比對，結果顯示，克隆的76118、R22株的S基因與相應標準株基因的序列一致性為99%，證實堿基序列正確，可用于后續體外轉錄等試驗。

2.3 重組質粒線性化

76118、R22株重組質粒分別經SpeⅠ、SacⅠ內切酶酶切后得到線性化質粒，經1%瓊脂糖凝膠電泳，線性化質粒較環形質粒電泳慢，結果與預期相符，顯示質粒線性化成功（圖2）。

2.4 cRNA標準品的定量

經核酸蛋白測定儀測定，體外轉錄的76118、R22 株 cRNA 的質 量濃 度分 別 為 86.6 和 17.58 ng/μL，D260nm/D280nm值分別為 2.09 和 1.87，符合純度要求。根據拷貝數換算公式，將轉錄產物分別梯度稀釋至1×1010～1×102拷貝/μL的標準品。

圖1 重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳1：76118株質粒擴增產物；2：R22株質粒擴增產物；M：250 bp DNA marker

2.5 RT-PCR鑒定cRNA標準品

以上述梯度稀釋的 1×1010～1×102拷貝/μL 的cRNA為模板進行熒光定量PCR鑒定，結果顯示76118和R22株的1×102拷貝/μL的標準品仍為陽性擴增（圖3）。

3 討論

圖2 重組質粒線性化對比結果

圖3 體外轉錄cRNA的RT-PCR擴增曲線A：76118株S基因體外轉錄cRNA的RT-PCR曲線；B：R22株S基因體外轉錄cRNA的RT-PCR曲線

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是重要的病毒性傳染病。根據血清學研究，引起HFRS的漢坦病毒主要有HTN、SEO、PUU、DOB等血清型，在我國以HTN型和SEO型為主。而且，與布尼亞科其他屬的病毒不同，漢坦病毒可以直接通過嚙齒類的排泄物、呼吸分泌物等接觸感染人[6]。該病為急性傳染病，致死率較高，疫源區分布廣泛，嚴重威脅人類的生命健康[7]。因此，建立模擬病毒RNA的標準品，對腎綜合征出血熱的早期診斷和治療具有重要意義。

漢坦病毒基因組中S片段編碼產物的保守性、抗原性和免疫原性較強，是主要的診斷抗原。我們以漢坦病毒S基因為研究對象，分別構建了HTN型76118株和SEO型R22株S片段全長含T7啟動子的重組質粒，測序證實質粒構建成功；經T7RNA聚合酶進行體外轉錄，獲得cRNA轉錄產物，可作為漢坦病毒的核酸擴增快速偵檢技術方法的陽性標準品。

目前，常用的漢坦病毒檢測方法有血清檢測和基因檢測，其中實時熒光定量PCR的靈敏性高，特異性好，操作簡便，被廣泛應用[8-10]。將特異性Taqman探針與目的基因特異性結合，在Taq酶的外切酶作用下將5'端標記熒光報告基團切下，發出熒光，大大提高了檢測的靈敏性和特異性[11]。本研究利用探針熒光定量法對體外轉錄產物進行鑒定，經連續梯度稀釋，含量換算成拷貝數為1×1010～1×102拷貝/μL的標準品，進行熒光定量PCR擴增。相對于質粒DNA的檢測，cRNA一步法檢測將RNA的反轉錄和PCR擴增一次性完成，避免了對環境的污染和反轉錄過程中的操作誤差，而且操作步驟減少可大大降低樣本RNA的降解，提高檢測結果的重復性和穩定性。

我們通過基因克隆和體外轉錄獲得含漢坦病毒S全長基因的cRNA產物，為建立和優化漢坦病毒快速檢測提供了陽性定量標準品，也為后續開展漢坦病毒的基因功能、疫苗等研究奠定了基礎。

[1] Wang Meiliang,Wang Jiuping,Wang Tianping,et al.Thrombo?cytopenia as a predictor of severe acute kidney injury in pa?tients with Hantaan virus infections[J].PLoS One,2013,8(1):e53236.

[2] 李家亮,李德新.漢坦病毒病原學研究進展[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2005,19(2):198-201.

[3] Hepojoki J,Strandin T,Lankinen H,et al.Hantavirus struc?ture--molecular interactions behind the scene[J].J Gen Virol,2012,93(8):1631-1644.

[4] Tischler N D,Rosemblatt M,Valenzuela P D T.Characteriza?tion of cross-reactive and serotype-specific epitopes on the nucleocapsid proteins of hantaviruse[J].Virus Res,2008,135(1):1-9.

[5] Aitichou M,Salen S S,McElroy A K,et al.Identification of Dobrava,Hantaan,Seoul,and Puumala viruses by one-step re?al-time RT-PCR[J].J Virol Methods,2005,124:21-26.

[6] Kruger D H,Ulrich R,Lundkvist A.Hantavirus infections and their prevention[J].Microbes Infect,2001,3(13):1129-1144.

[7] Bi Zhenqiang,Formenty P B H,Roth C E.Hantavirus infec?tion:a review and global update[J].J Infect Dev Ctries,2008,2(1):3-23.

[8] Takaaki K,Kumiko Y,Midori T,et al.Development of a se?rotyping enzyme-linked immunosorbent assay system based on recombinanttruncated hantavirus nucleocapsid proteins for New World hantavirus infection[J].J Virol Methods,2012,185:74-81.

[9] Mohamed N,Nisson E,Johansson P,et al.Development and evaluation of a broad reacting SYBR-green based quantitative real-time PCR for the detection of different hantaviruses[J].J Clin Virol,2013,58:280-285.

[10]Garin D,Peyrefitte C,Crance J M,et al.Highly sensitive Taqman PCR detection of Puumala hantavirus[J].Microbes In?fect,2001,3:739-745.

[11]Sibley C D,Peirano G,Church D L.Molecular methods for pathogen and microbial community detection and characteriza?tion:Current and potential application in diagnostic microbiolo?gy[J].Infect Genet Evol,2012,12:505-521.