2型單純皰疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表達及其對Ve?ro細胞活性的影響

鐘菲菲，楊慧蘭，樊建勇 ，劉巖 ，高睿迪 ，游韶平

1.廣州軍區 廣州總醫院，廣東 廣州 510010；2.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）主要包括1型（HSV-1）和2型（HSV-2），兩型病毒堿基有70%的同源性。HSV-1感染面部，潛伏在三叉神經節；HSV-2主要感染生殖器，并在骶尾神經節建立長期潛伏，是引起生殖器皰疹的主要病原體[1]，潛伏的病毒可因各種非特異性刺激而復發，產生相應的臨床癥狀。目前還無特效藥物控制HSV的感染和復發，而且其潛伏復發的分子機制不明確。HSV-2基因表達過程受到級聯作用的調節，這些病毒基因可被分成三大類，包括立即早期（IE）基因、早期（E）基因和晚期（L）基因。ICP34.5（infected cell protein 34.5）是由晚期基因編碼的神經毒性因子，是一種蛋白激酶R抑制劑，對病毒的復制和致病性起關鍵作用[2-5]。ICP34.5基因由長重復序列RL1區域編碼，與潛伏相關轉錄本（latency-associated transcripts，LAT）反向互補，研究表明其受多種機制調控。ICP4可促進ICP34.5的表達[6]，HSV-2 LAT編碼的miRNA靶向 ICP34.5 的 5'UTR 和外顯子 1[7-9]，通過調節ICP34.5的表達，對病毒的潛伏與復發有重要作用。為此，我們構建了HSV-2 ICP34.5真核表達質粒，確認其能在Vero細胞中表達，并且能降低空質粒對Vero細胞的損傷作用，為進一步研究HSV-2 ICP34.5對宿主細胞的生物學作用和病毒潛伏與復發機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、大腸桿菌TOP10、HSV-2 333標準株、質粒pEGFP-C2由本實驗室保存；KOD FX Neo聚合酶購自東洋紡公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；病毒基因組提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自Hyclone公司；限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ為NEB公司產品；胰酶Giboc、轉染試劑盒Xfect購自Clontech公司；逆轉錄試劑盒購自Promega公司；MTT、DMSO購自Sigma公司。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank中HSV-2 333株的LAT ICP34.5序列，用Primer Premier 5.0設計PCR引物并添加酶切位點和保護堿基。上游引物為P1（5'-CGGGG?TACCAGGGGCCGTCCGAACGTTTTT-3'），下游引物為 P2（5'-CCCAAGCTTCGTGCATGCGTGCCGAGT?GAA-3'）（上、下游引物分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點）。內參β-actin上游引物為P3（5'-CGTAC?CACTGGCATCGTGAT-3'），下游引物為 P4（5'-GT?GTTGGCTGACAGGTCTTTG-3'）。引物由上海 Invit?rogen公司合成。

1.3 Vero細胞的培養

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下對Vero細胞進行常規培養，2～3 d傳代一次。

1.4 病毒的接種及基因組的提取

HSV-2感染Vero細胞后，于顯微鏡下觀察細胞病變，待70%～80%細胞發生病變時收集細胞，反復凍融使細胞充分裂解，低速離心后取上清液，用病毒基因組提取試劑盒提取HSV-2基因組。

1.5 ICP34.5片段的PCR擴增

以提取的HSV-2 333株基因組為模板，PCR擴增ICP34.5片段。反應體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP混合液10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，補滅菌蒸餾水至50 μL，瞬時離心混勻。PCR反應條件為94℃ 5 min，然后以98℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min行 36個循環，72℃延伸 10 min后冷卻至4℃。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.6 pEGFP-C2質粒和ICP34.5片段的雙酶切及酶切產物回收

將純化的ICP34.5目的片段和pEGFP-C2質粒用限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ分別雙酶切，反應完畢后0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，分別回收線性載體和ICP34.5片段，具體回收步驟參照TaKaRa公司的膠回收試劑盒說明書。

1.7 ICP34.5片段與pEGFP-C2質粒的連接及轉化

ICP34.5片段與pEGFP-C2質粒連接反應體系包括ICP34.5片段酶切回收產物5 μL、pEGFP-C2質粒酶切回收產物 2 μL、T4DNA 連接酶 1.0 μL、T4DNA連接酶緩沖液1 μL，補滅菌蒸餾水至10 μL。瞬時離心后放入PCR儀中于16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，均勻涂布于含60 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基上，靜置30 min，再倒置培養16 h。

1.8 重組質粒的提取和鑒定

1.8.1 菌落PCR鑒定 挑取卡那霉素抗性平板上的陽性菌落，進行菌落PCR。除模板外，PCR反應體系、反應條件及循環參數與擴增ICP34.5片段相同。以HSV-2基因組為模板做陽性對照。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶。

1.8.2 重組質粒的雙酶切及測序鑒定 選取只能擴增出與陽性對照有一致條帶的重組質粒進行KpnⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切體系和pEGFP-C2質粒雙酶切相同，酶切條件為37℃水浴酶切過夜。酶切產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將同一陽性克隆的菌液送上海英駿公司，用pEGFP-C2質粒的通用引物測序。

1.9 重組質粒轉染Vero細胞

待6孔板中的細胞生長密度達80%～90%時，用Xfect轉染試劑盒分別將 pEGFP-C2/LAT-ICP34.5、pEGFP-C2轉染至Vero細胞，具體步驟參照轉染試劑盒說明書。48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合蛋白的表達情況。

1.10 RT-PCR鑒定LATICP34.5在Vero細胞中的表達

轉染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察Vero細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，并收獲細胞提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以此為模板，PCR擴增ICP34.5及β-actin。反應體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP 混合液 10 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，引物P1、P2或P3、P4各2 μL，逆轉錄產物 cDNA 2 μL，加雙蒸水至 50 μL。擴增ICP34.5/β-actin基因的條件為94℃預變性5 min，然后以98℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min行35個循環，72℃延伸10 min后冷卻至4℃。PCR產物經0.8%瓊脂糖電泳鑒定。

1.11 重組質粒對Vero細胞活性的影響

重組質粒pEGFP-ICP34.5及空白質粒pEGFPC2轉染Vero細胞48 h后，在96孔培養板的每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃孵育4 h，吸出培養基，每孔加200 μL DMSO溶解結晶，微型振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀（Biocell）測定D490nm值，每個實驗組設6個復孔，重復3次。

1.12 統計分析

實驗結果采用SPSS16.0軟件進行分析，各組數據均以x±s表示，各組間兩兩比較采用單因素的方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 目的片段的擴增

以提取的HSV-2 333標準株基因組為模板，擴增出的條帶和目標條帶大小一致（加上酶切位點和保護堿基約1400 bp）（圖1）。

2.2 重組質粒pEGFP-C2/ICP34.5的雙酶切和測序鑒定

重組質粒經限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，可獲得約1400 bp和4.7 kb的條帶（圖2），說明目的片段已插入真核表達載體pEGFP-C2。上海英駿公司測序結果（略）與GenBank中的HSV-2 333標準株ICP34.5序列一致，表明重組質粒pEGFPICP34.5構建成功。

2.3 RT-PCR 檢測重組質粒 pEGFP-C2/ICP34.5 在Vero細胞中的表達

圖1 目的片段HSV-2 ICP34.5的PCR產物M：Wide range DNA marker；1：ICP34.5擴增產物

轉染48 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察發現重組質粒pEGFP-C2/ICP34.5在Vero細胞中有表達，表現為強綠色熒光。RT-PCR結果表明，只有從轉染重組質粒pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞中提取的RNA才能擴增出ICP34.5基因，而β-actin（452 bp）在轉染了2種質粒的Vero細胞中所提取的RNA中均可擴增出來（圖3）。

2.4 重組質粒表達的綠色熒光在Vero細胞中的分布特點

轉染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的分布情況，可見重組質粒pEGFP-ICP34.5表達的綠色熒光（圖4A）主要集中在細胞核，大多數為圓形，形態規則，分布均勻；而空質粒pEGFP-C2表達的綠色熒光（圖4B）在細胞核和細胞質中都有分布，且不規則，與重組質粒組相比，熒光強度較弱。

2.5 MTT法測重組質粒對Vero細胞活性的影響

MTT法測定的D490nm值與細胞存活量成正比。轉染了質粒的細胞D490nm值都低于正常對照組，說明轉染質粒對細胞有一定的損傷作用；轉染了重組質粒 pEGFP-ICP34.5 的 Vero細 胞 D490nm值（1.744±0.121）明顯高于空質粒pEGFP-C2組（1.523±0.117）（P＜0.05），與正常對照組（1.781±0.132）（P＜0.05）無顯著差異，而轉染空質粒組與正常對照組差異顯著（P＜0.05），說明HSV-2 ICP34.5能降低空質粒對細胞的損傷作用（圖5）。

圖2 重組質粒pEGFP-ICP34.5的酶切M：Wide range DNA marker；1：KpnⅠ酶切pEGFP-ICP34.5；2：KpnⅠ、HindⅢ雙酶切pEGFP-ICP34.5

圖3 RT-PCR鑒定HSV-2 ICP34.5基因在Vero細胞中的表達M：Wide range DNA marker；1：陰性對照；2：轉染pEGFP-C2的Vero細胞組β-actin內參條帶；3：轉染pEGFP2-C2的Vero細胞組無目的片段；4：轉染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞組的ICP34.5片段；5：轉染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞組β-actin內參條帶

圖4 質粒表達的綠色熒光在Vero細胞中的分布特點（200×）A：轉染重組質粒48 h后Vero細胞中的熒光表達情況；B：轉染空質粒48 h后Vero細胞中的熒光表達情況

圖5 MTT法檢測重組質粒對Vero細胞活性的影響A：轉染pEGFP-ICP34.5的Vero細胞；B：轉染pEGFP-C2的Vero細胞；C：正常Vero細胞

3 討論

當病毒感染細胞時，病毒對細胞各個系統的影響從不同的角度形成了一個復雜的交互作用網絡，使細胞的各個環節都陷入病毒的控制之中，使病毒在一定的細胞狀態下獲得最大可能的生存機會。同其他病毒一樣，HSV也進化出了一系列逃避宿主抗病毒的策略[10]，其中很重要的一點是ICP34.5抵御宿主的抗病毒作用，它可以抑制1型干擾素的產生及其效應，為病毒基因組在細胞內的穩定存在創造條件，促進HSV在細胞內的潛伏[11-12]。

HSV-1 ICP34.5是由γ134.5基因編碼的病毒毒力蛋白。其C端結構與GADD相應結構域同源，發揮磷酸輔助因子的功能，能結合蛋白磷酸酶，使其功能逆轉，從而對CIF-2a去磷酸化，這可使由蛋白激酶R激活而導致的蛋白合成終止作用被去除。另外，其N端能通過RNase形成的鍵而結合Us11基因。在HSV-1感染的細胞中，dsRNA依賴性的蛋白激酶PKR會被激活，然后將elF2的亞基磷酸化。這是宿主細胞的抗病毒機制，會造成宿主細胞蛋白合成的停止，從而抑制病毒的復制。為逃避宿主細胞的這種抗病毒機制，ICP34.5會與細胞中的蛋白磷酸酶1及elF2a結合，形成一種大分子的復合物，并使elF2a脫磷酸化。因此，ICP34.5可以重新開啟宿主細胞蛋白合成，同時幫助病毒完成自身的蛋白合成。

自噬在對抗病毒感染、避免病毒逃逸中有重要作用。自噬基因beclin-1的表達為宿主自噬作用所必需，有文獻報道，ICP34.5缺失突變株病毒粒子不能正常地從細胞核中釋放，同時喪失了同beclin-1結合的能力，從而無法破壞beclin-1介導的宿主抗病毒自噬作用[13-15]，病毒復制所必需的毒力因子ICP34.5有可能是通過靶標宿主自噬關鍵蛋白Be?clin-1來發揮毒力作用的。通過遺傳學手段阻斷PKR（自噬誘導信號分子），可以使自噬抑制缺陷的病毒毒力得到回復，進一步說明自噬在抵抗病毒感染中起重要作用。

但是，HSV-1和HSV-2的致病作用存在明顯的差異，通常HSV-2比HSV-1在多種動物模型中具有更強的神經毒力。與HSV-1 ICP34.5同系物不同的是，HSV-2 ICP34.5的編碼基因是一個經過選擇性剪接并含有一個內含子的基因[16]。另外，HSV-1 ICP34.5與TBK1和Beclin-1結合等重要功能與其N端有關，而在HSV-2 ICP34.5中卻未證實與N端有關。HSV-1和HSV-2 ICP34.5編碼基因具有較高的同源性（約80%），特別是在逆轉eIF2a磷酸化過程中起重要作用的C端具有更高的同源性，而國內外對HSV-2 ICP34.5的研究鮮有報道。在本實驗中，我們構建了HSV-2 ICP34.5真核表達載體，實現了其在Vero細胞中的表達，為后續研究ICP34.5在HSV-2潛伏與復發中的作用奠定了實驗基礎。

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