艾灸預處理對腦缺血再灌注損傷模型大鼠大腦皮質caspase-3蛋白表達的影響*

肖愛嬌 康明非 張 毫 龔麗麗

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的80%左右[1]，其中大多由大腦中動脈阻塞引起。目前國際上通常采用溶栓療法[2]以恢復腦組織血流供應，但再灌注本身有時也可加重組織的功能障礙和結構損傷，即引起腦缺血再灌注損傷。因此，腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病的重要病理過程。有研究認為，細胞凋亡參與了腦缺血再灌注損傷的發病過程[3]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在細胞凋亡中起重要調控作用，其激活后可引起細胞形態結構改變和DNA片段化[4]。研究發現，腦缺血再灌注后caspase-3的表達明顯增加[5]。本課題前期預實驗發現，艾灸預處理“大椎”穴能縮小大腦中動脈缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，減輕腦缺血再灌注損傷。本研究建立大腦中動脈栓塞（mid?dle cerebral artery occlusion,MCAO）缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察艾灸預處理對大腦皮質caspase-3蛋白表達的影響，以探討艾灸預處理減輕腦缺血再灌注損傷的機制，旨在為艾灸治未病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級雄性SD大鼠21只，體質量220～280 g，購自江西中醫藥大學實驗動物中心（合格證編號：JZDW2011-0336）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（6只）、模型組（8只）和艾灸預處理組（7只）。模型組：行MCAO手術，2 h后行再灌注。假手術組：同模型組，但不插栓線。艾灸預處理組：艾灸“大椎”穴后行MCAO手術，2 h后行再灌注。3組術后均單籠飼養。納入標準：腦缺血再灌注時神經功能缺失評分為1～3分且存活≥3 d者。本實驗模型組死亡2只、艾灸預處理組死亡1只。

1.2 主要試劑及儀器 caspase-3抗體（美國Cell Signaling technology公司產品），羅丹明標記的山羊抗兔IgG（美國KPL公司產品）；CM 1950衡冷低溫切片機、Leica 2000顯微鏡及圖像分析系統（德國Leica公司）。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型制備 參照文獻[6-7]的頸內動脈線栓法并略做改良，即大鼠用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，將頸總動脈近心端、頸外動脈用絲線扎緊，頸總動脈遠心端上打一活結，頸內動脈用微動脈夾夾閉，用眼科剪在頸總動脈上剪一V形小切口，用前端蘸有石蠟的魚線（直徑0.237 mm）插入頸總動脈，此時稍扎緊活結以減少或避免出血，松開微動脈夾，用鑷子夾緊魚線，沿頸內動脈直進入大腦中動脈開口處，插入深度從分叉處算起約22 mm，線栓尾端引出皮膚切口，便于拔線。假手術組同模型組，只是不插栓線。大鼠MCAO 2 h后將栓線向外拔出1 cm左右以進行再灌注。術中和術后室溫控制在25℃左右。

1.4 艾灸治療方法 將艾灸預處理組大鼠項部的毛發剪去，露出“大椎”穴作為艾灸穴位。用直徑0.4 cm、長10 cm的艾條（江西中醫藥大學附屬醫院制），距穴位2 cm左右溫和灸大鼠，1次/d，15 min/次，共10 d。

1.5 腦組織梗死檢查 于MCAO造成腦缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后在冰上迅速取腦，將腦置于-20℃冰箱快速冷凍20 min，以2 mm左右間隔自額向枕切成5個冠狀切片，放入1%TTC染液中，置于37℃溫箱中染色20 min，用甲醛溶液進行固定后拍照，計算腦梗死體積與全腦體積的百分比。

1.6 腦組織病理檢查 大體觀察腦組織外觀后再行光鏡和電鏡檢查。光鏡檢查：于MCAO造成腦缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，用預冷的(4℃)4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注，然后在冰上迅速取腦，分離大腦皮質，切取小塊置于甲醛溶液中固定，再經石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察大腦皮質形態結構。電鏡檢查：將大鼠腦組織分離大腦皮質，切取1 mm3的小塊置于2.5%戊二醛溶液中固定，然后放入1%鋨酸后固定2 h，PBS沖洗2次，經各級乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋烘烤，進行超薄切片，經醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色等步驟，最后透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.7 熒光免疫組織化學法檢測大腦皮質caspase-3蛋白水平 將大鼠腦組織分離大腦皮質，切取小塊置于4%多聚甲醛溶液中后固定4～6 h，然后移至梯度蔗糖溶液中脫水。待組織塊下沉后，于-20℃進行大腦皮質冰凍切片，厚35 μm，于切片保護液中-20℃保存。每只大鼠取6片，PBS漂洗、正常血清封閉后加入兔抗大鼠caspase-3抗體（1∶400），4℃孵育過夜，陰性對照組不加一抗，用PBS代替。PBS液清洗后，加入羅丹明標記的山羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育1.5 h。風干，熒光封片劑封固，熒光顯微鏡觀察，拍照。細胞涂片上有caspase-3的部位呈紅色，分別計數每張圖片的caspase-3陽性細胞數。

1.8 統計學方法 計量指標以x±s表示，用SPSS 10.0進行分析，3組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腦組織梗死觀察 大鼠腦缺血再灌注后3 d，假手術組腦組織全部染成紅色，未見白色梗死灶。模型組左側半球有白色梗死灶，右側半球呈紅色。艾灸預處理組左側半球有白色梗死灶，但較模型組明顯縮小；右側半球呈紅色，見圖1。模型組腦組織梗死體積百分比明顯大于假手術組和艾灸預處理組(P＜0.05)，見表1。

Table 1 The percentage of infarct size and caspase-3 positive cells after 3 days of reperfusion表1 各組腦組織梗死體積百分比及caspase-3陽性細胞數 （x±s）

2.2 大鼠腦組織病理觀察 假手術組：肉眼觀察可見腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰。鏡下見大腦皮質神經細胞排列致密、整齊；細胞結構完整、邊緣清晰。模型組：肉眼觀察可見左側腦組織表面蒼白、出現液化，且腦溝變淺、腦回變寬。鏡下見梗死側大腦皮質大量神經細胞變性壞死、萎縮。艾灸預處理組：肉眼觀察可見左側半球腦組織表面較蒼白，腦溝及腦回較清晰。鏡下見梗死側大腦皮質神經細胞排列較致密，細胞損傷較模型組明顯減輕。見圖2。

2.3 電鏡觀察 假手術組：大腦皮質神經細胞層厚，密度大，排列整齊、緊密；細胞結構完整、邊緣清晰。模型組：患側大腦皮質細胞層變薄，細胞間隙增大，排列紊亂、疏松；細胞結構不完整，甚至有大量細胞缺失，核膜不完整，核染色質邊聚。艾灸預處理組：患側大腦皮質神經細胞層厚，密度大，排列較整齊、緊密；細胞結構完整、邊緣清晰。見圖3。

2.4 大鼠大腦皮質caspase-3陽性細胞數 大腦皮質中表達caspase-3蛋白的部位呈現紅色，見圖4。模型組大腦皮質caspase-3陽性細胞數多于假手術組和艾灸預處理組(P＜0.05)，見表1。

3 討論

自1990年Kitagawa等[8]在沙土鼠腦缺血的實驗研究中觀察到缺血預處理的腦保護作用后，其他學者又陸續觀察到采用其他多種預處理方式如缺氧、低氧、高溫、針刺預處理等均可以引起機體對再次嚴重缺血的耐受。然而相對于西醫利用短暫的缺血、缺氧、高溫等預處理方法[9]來說，艾灸預處理具有創傷小、易于調控的優勢，而且刺激溫和，易于接受。

艾灸預處理即“逆灸”，屬于逆針灸的一部分，是以“治未病”為主要理論基礎的防病保健方法。它是通過艾灸激發經絡之氣，提高機體抗病能力，從而達到防止疾病的發生、減輕隨后疾病的損害和保健延年的目的。研究發現艾灸預處理具有抗感染、調節機體免疫功能等作用[10]。近年有研究采用“4-動脈阻斷”方法建立大鼠全腦缺血模型，觀察到艾灸預處理能有效地誘導腦缺血耐受，具有神經保護作用[11]。然而，關于艾灸預處理能否減輕腦缺血再灌注損傷的報道還不多見。本研究結果顯示艾灸預處理可縮小腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，減輕腦缺血再灌注損傷。

近年來研究證實，在腦缺血再灌注引起的腦組織損傷進展過程中，有許多相互關聯的機制在起作用，涉及的主要病理生理過程有能量耗竭、離子紊亂、神經遞質失調、酸中毒、興奮性毒性、炎癥、血管通透性改變、氧化應激和細胞凋亡等[3]。其中，細胞凋亡可能在腦缺血性腦損傷的病理過程中起重要作用。研究表明，腦缺血后神經元除壞死之外，還存在另一種死亡形式，即細胞凋亡，腦缺血再灌注可引起腦細胞凋亡[12]。本研究大腦皮質電鏡觀察結果提示，大鼠腦缺血再灌注后發生了細胞凋亡，而艾灸預處理具有抑制細胞凋亡的作用。但具體作用機制還不十分清楚。

近年來，caspase-3在細胞凋亡中的作用備受關注。有研究表明caspase-3在細胞凋亡中起著重要的調控作用，被認為是細胞凋亡過程中的主要執行者，可水解多種蛋白底物，包括細胞骨架蛋白、細胞周期調節蛋白、細胞信號轉導蛋白、DNA修復調節因子以及細胞存活等環節中重要的蛋白，導致細胞凋亡[4]。腦缺血再灌注后大腦皮質caspase-3蛋白表達明顯增加[5]。本研究結果提示，艾灸預處理可能通過降低大腦皮質caspase-3蛋白的表達而達到減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上，大腦中動脈缺血2 h后進行再灌注引起的大腦皮質caspase-3蛋白表達增加可能是造成腦缺血再灌注損傷發生機制之一，而減少大腦皮質caspase-3蛋白表達則可能是艾灸預處理“大椎”穴減輕腦缺血再灌注損傷、發揮腦保護效果的作用機制之一。

（圖1~4見插頁）

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