T細(xì)胞免疫應(yīng)答在乙型肝炎病毒感染者診斷中的應(yīng)用及對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療的影響

苑文雯，王 晗，朱劍功，王大剛，楊 寧，李沛然，李 妍，耿 偉，何葉莉，郭桐生

(中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，北京 100039)

T細(xì)胞免疫應(yīng)答在乙型肝炎病毒感染者診斷中的應(yīng)用及對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療的影響

苑文雯，王 晗，朱劍功，王大剛，楊 寧，李沛然，李 妍，耿 偉，何葉莉，郭桐生

(中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，北京 100039)

目的探討T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的檢測(cè)在乙型肝炎病毒感染者診斷以及免疫調(diào)節(jié)治療中的價(jià)值。方法選擇2013年7月至2014年2月就診并符合納入標(biāo)準(zhǔn)的40例患者，于治療前及免疫調(diào)節(jié)治療1個(gè)月、3個(gè)月采集外周血，同時(shí)選擇同期健康體檢者40例作為對(duì)照，分別對(duì)血清ALT、AST及T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與對(duì)照組比較，慢性乙型肝炎患者外周血CD3+T、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著降低(P＜0.01)，免疫調(diào)節(jié)治療過(guò)程中，各指標(biāo)均逐漸升高(P＜0.01)。而慢性乙型肝炎患者血清ALT、AST及外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)水平則顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療，各指標(biāo)水平逐漸下降(P＜0.01)。慢性乙型肝炎血清中ALT、AST水平與CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)(P＜0.01)呈正相關(guān)；與CD4+/CD8+T比值(P＜0.01)呈明顯負(fù)相關(guān)。結(jié)論乙型肝炎病毒感染患者感染期及免疫調(diào)節(jié)治療不同階段T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平不同，對(duì)乙型肝炎病毒感染者的診斷以及免疫調(diào)節(jié)治療有指導(dǎo)意義。

乙型肝炎病毒；T淋巴細(xì)胞；免疫應(yīng)答；免疫調(diào)節(jié)治療

乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝細(xì)胞、非細(xì)胞毒性病毒，也是引起慢性肝炎最常見的病毒之一。我國(guó)是HBV感染的高流行區(qū)，約占全世界HBV感染者的1/3。慢性乙型肝炎具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但可以通過(guò)誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)從而間接損傷肝細(xì)胞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，抗原特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能失調(diào)與慢性乙型肝炎的發(fā)生密切相關(guān)[2]。其中，CD4+T細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致機(jī)體對(duì)HBV產(chǎn)生免疫耐受被認(rèn)為是感染持續(xù)的重要因素[3]。

曾有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)慢性乙型肝炎患者外周血中T細(xì)胞亞群的變化，但關(guān)于T細(xì)胞亞群在慢性乙型肝炎發(fā)病及免疫調(diào)節(jié)治療中動(dòng)態(tài)變化的研究較少。我們對(duì)病理診斷確診為慢性乙型肝炎的患者未經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療時(shí)及治療過(guò)程中外周血中各T細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，從而系統(tǒng)全面地評(píng)價(jià)T細(xì)胞免疫應(yīng)答在乙型肝炎病毒感染者診斷及治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取自2013年7至2014年2月就診的慢性乙型肝炎患者共40例，其中男性25例，女性15例，年齡30～50歲，平均(39.2±8.5)歲。選擇同期健康體檢者40例作為正常對(duì)照組，其中男性25例，女性15例，年齡25～55歲，平均(38.6±9.2)歲，均無(wú)其他自身免疫性疾病，肝功能正常者。兩組研究對(duì)象的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。所有血液樣本的收集均征得患者及體檢者本人的書面知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①診斷均符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]以及2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]制定的標(biāo)準(zhǔn)；②不具備排除標(biāo)準(zhǔn)中的任一項(xiàng)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①重疊其他類型病毒性肝炎、自身免疫性或藥物及酒精性肝炎；②伴有其他自身免疫性疾病；③在納入實(shí)驗(yàn)前未進(jìn)行抗病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療。

1.3 樣本采集 慢性乙型肝炎患者于治療前及進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療后第1個(gè)月、第3個(gè)月靜脈采集外周血樣本，分別記為G0、G1、G3組；采集對(duì)照組外周血樣本，記為Gn組。所有外周血樣本經(jīng)抗凝處理后，置于室溫，避光條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)選取 根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)為肝內(nèi)炎癥判斷指標(biāo)；測(cè)定外周血中T細(xì)胞亞群CD3+T、CD4+T、CD8+T百分?jǐn)?shù)及CD4+T/ CD8+T比值。

1.5 檢測(cè)方法 使用Olympus AU 5400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST，采用FACS Calibur流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。符合正態(tài)分布且方差齊者使用單因素方差分析，否則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，相關(guān)性檢驗(yàn)用直線相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r，取P=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清ALT、AST水平 G0、G1、G3組血清ALT、AST水平均顯著高于對(duì)照組，其中G0組最為突出，提示此時(shí)病情最為嚴(yán)重，在免疫調(diào)節(jié)治療過(guò)程中，G1、G3組的血清ALT、AST水平相比G0組逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 患者與對(duì)照組血清中ALT、AST水平比較()

表1 患者與對(duì)照組血清中ALT、AST水平比較()

?

2.2 外周血T細(xì)胞亞群 G0、G1、G3組外周血CD4+T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+T比值均低于Gn組，而CD8+T細(xì)胞亞群則高于Gn組，其中G0組最為顯著。由G0到G3組，CD4+T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+T比值逐漸升高，CD8+T細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)呈降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 患者血清ALT、AST水平與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析 將慢性乙型肝炎患者外周血各指標(biāo)與肝功能指標(biāo)ALT、AST進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清ALT、AST與CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)水平呈正相關(guān)，而與CD4+/CD8+T比值呈明顯負(fù)相關(guān)，見表3。

表2 患者與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較()

表2 患者與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較()

Gn組G0組G1組G3組F值P值70.32±6.42 60.75±3.06 63.85±4.65 65.79±4.80 95.32 0.00 41.2±6.03 25.45±2.28 29.95±4.38 31.10±3.77 57.40 0.00 22.35±4.33 33.05±3.07 29.35±3.18 27.83±2.66 34.74 0.00 1.930.59 0.710.09 1.030.16 1.120.18 52.10 0.00

表3 患者血清ALT、AST水平與各指標(biāo)間相關(guān)性分析

3 討論

機(jī)體的免疫功能主要包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中細(xì)胞免疫應(yīng)答主要由T細(xì)胞介導(dǎo)[6]。外周血CD4+T細(xì)胞可分為Th0、Th1、Th2等功能性亞群，由Th1細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素2(IL-2)、干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等細(xì)胞因子主要介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫，促進(jìn)乙肝病毒的清除，Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子則主要促進(jìn)體液免疫反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞包括Tc1和Tc2兩個(gè)細(xì)胞亞群，其中Tc1可分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子并且可發(fā)揮細(xì)胞毒的作用，與Th1共同參與宿主的抗病毒免疫[7]。外周血T細(xì)胞的數(shù)量、功能及各亞群的構(gòu)成比反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，在某些疾病狀態(tài)中，任何一種細(xì)胞亞群的失調(diào)都會(huì)影響T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，乙肝患者外周血中的CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值也明顯降低，這可能與感染的慢性化有關(guān)，慢性HBV感染的病程消耗了大量T淋巴細(xì)胞，使外周血中CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低，CD4+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞減少及細(xì)胞亞群比例失調(diào)都會(huì)引起細(xì)胞因子表達(dá)紊亂，導(dǎo)致不能及時(shí)清除HBV[9]。與對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)則明顯升高，可能是HBV抗原長(zhǎng)期慢性刺激的結(jié)果，CD8+T淋巴細(xì)胞中的抑制性T細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞具有抑制作用，使得機(jī)體不能及時(shí)清除乙肝病毒，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

免疫調(diào)節(jié)治療提高了機(jī)體的免疫功能，尤其是對(duì)HBV的特異性免疫，從而打破對(duì)HBV的免疫耐受，有利于HBV清除。CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值均較治療前呈增加趨勢(shì)，隨著療程的增長(zhǎng)，各個(gè)治療時(shí)期的T細(xì)胞亞群水平與治療前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果表明，對(duì)HBV感染患者進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療，不僅能夠抑制乙肝病毒的復(fù)制，而且能調(diào)動(dòng)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，打破機(jī)體的免疫耐受，恢復(fù)T細(xì)胞的功能[10]。

本研究中，我們主要探討了HBV感染者未經(jīng)治療時(shí)及免疫調(diào)節(jié)治療中外周血中T細(xì)胞亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子的變化，T細(xì)胞亞群以及相應(yīng)細(xì)胞因子在HBV感染發(fā)病及免疫調(diào)節(jié)治療的不同階段變化顯著，提示我們T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平不僅是HBV感染者診斷中的重要指標(biāo)，在免疫調(diào)節(jié)治療中及時(shí)對(duì)患者T細(xì)胞免疫應(yīng)答水平進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，對(duì)后續(xù)治療計(jì)劃的制定及患者預(yù)后的判斷也起到重要的指導(dǎo)作用。

[1]張 艷,許春梅,左維澤,等.乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞亞群、IL-32、IL-6水平的變化及其臨床意義[J].胃腸病學(xué),2010,15(8): 47-51.

[2]廖崇倫,陳 萍.乙型肝炎病毒感染人群T細(xì)胞對(duì)其抗原蛋白免疫應(yīng)答的特征分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2013,23(12): 2791-2792,2795.

[3]程勇祥.老年內(nèi)科腎衰竭患者血液透析的療效及感染的預(yù)防[J].臨床合理用藥,2012,5(6C):111-113.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志,2000,8(6):324-329.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].實(shí)用肝臟病雜志,2006,9(1):8-18.

[6]Kitagishi Y,Kobayashi M,Yamashina Y,et al.Elucidating the regulation of T cell subsets(review)[J].Int J Mol Med,2012,30(6): 1255-1260.

[7]馮 霞,閆惠平,廖慧鈺,等.不同類型乙肝病毒感染者HBV抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2012,26 (4):253-255.

[8]李俊卿.免疫細(xì)胞在慢性乙型肝炎免疫耐受機(jī)制中的作用[J].臨床肝膽病雜志,2011,27(4):437-440.

[9]Vossenk?mper A,Lutalo PMK,Spencer J.Translational Mini-Review Series on B cell subsets in disease.Transitional B cells in systemic lupus erythematosus and Sj?gren's syndrome:clinical implications and effects of B cell-targeted therapies[J].Clinical&Experimental Immunology,2012,167(1):7-14.

[10]福軍亮,王福生.慢性乙型肝炎患者的個(gè)體化免疫調(diào)節(jié)治療[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(4):300-304.

Application of T cell's immune response in the diagnosis of hepatitis B virus infection and its effect onimmunomodulatory therapy.

YUAN Wen-wen,WANG Han,ZHU Jian-gong,WANG Da-gang,YANG Ning,LIPei-ran,LI Yan,GENG Wei,HE Ye-li,GUO Tong-sheng.

Clinical Laboratory Medical Center,the 302ndHospital of Chinese PLA,Beijing 100039,CHINA

ObjectiveTo evaluate the value of T cell's immune response in the diagnosis of hepatitis B virus infection and its effect on immunomodulatory therapy.MethodsA total of 40 patients who had hepatitis B and have been treated at the hospital from Jul.2013 to Feb.2014 were selected as the objects(the study group).The peripheral blood of the patients was collected before immunomodulatory treatment,1 month and 3 months after treatment.At the same time,40 healthy volunteers were selected as control group(the control group).Alanine aminotransferase(ALT), aspertate Aminotransferase(AST)and T-cell subsets were detected and analyzed statistically.ResultsCompared to the control group,the percentage of CD3+T and CD4+T cell,the ratio of CD4+/CD8+T cell in the study group were significantly decreased(P＜0.01).During the immunomodulatory treatment,all the indexes increased gradually(P＜0.01). However,ALT,AST and the percentage of CD8+T cell were significantly increased in the study group(P＜0.01),andthey were significantly decreased after treatment(P＜0.01).ALT,AST level in the study group were positively correlated with the percentage of CD8+T cell(P＜0.01),and were negative correlated with the ratio of CD4+/CD8+T cell(P＜ 0.01).ConclusionThe patients in hepatitis B virus infection stage and different stages of immunomodulatory therapy vary in T cell's immune response,which can,to a certain extent,guide hepatitis B diagnosis and clinical treatment with immunomodulatory.

Hepatitis B virus;T cell;Immune response;Immunomodulatory therapy

R512.6+2

A

1003—6350（2014）24—3658—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1425

2014-06-15)

郭桐生。E-mail：yuanww1988@163.com