FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織及正常鼻咽組織中的表達

羅海清，黃 靜，楊東紅，陳梓宏，余忠華

（廣東醫學院附屬醫院腫瘤中心二區，廣東 湛江 524001）

FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織及正常鼻咽組織中的表達

羅海清，黃 靜，楊東紅，陳梓宏，余忠華

（廣東醫學院附屬醫院腫瘤中心二區，廣東 湛江 524001）

目的研究FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織以及正常鼻咽組織中的表達及其臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR(RQ-RT-PCR)方法和免疫組織化學染色法分析檢測54例鼻咽癌組織和28例正常鼻咽組織FHIT基因和蛋白表達水平。結果鼻咽癌組織中FHIT基因和蛋白的表達顯著低于正常鼻咽組織（P＜0.050），且FHIT基因和蛋白的表達與病理分化程度、臨床分期密切相關(P＜0.05)，與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關(P＞0.05)。結論FHIT基因和蛋白可能有助于鼻咽癌的診斷，它可作為鼻咽癌的預后因子。

FHIT；鼻咽癌；基因；蛋白；表達

鼻咽癌是目前中國南方地區最常見的惡性腫瘤之一。世界衛生組織調查報道，全球有80%的鼻咽癌患者在中國。中國鼻咽癌每年的發病率為30/10萬～50/10萬，男性發病率是女性的三倍。由于大多數鼻咽癌確診時已是晚期，因此研究鼻咽癌的分子標志物對于鼻咽癌的早期診斷和治療具有重要的意義。FHIT基因是1996年由Ohta等發現的一個抑癌基因，它位于位于染色體3p14.2，含10個外顯子。幾乎在所有組織都可以檢測到FHIT基因的表達，包括：肺、乳腺、腦、肝臟、腎臟、前列腺、宮頸、卵巢等。研究發現FHIT蛋白的過度表達，可引起腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤的發生[1]。FHIT基因的失活或缺失可導致乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、宮頸癌的發生，但它與鼻咽癌的發生關系確少見報道。本研究采用RQ-RT-PCR方法和免疫組織化學染色法檢測54例鼻咽癌組織和28例鼻咽正常組織中FHIT基因和FHIT蛋白的表達水平，并分析其與各臨床病理特征的相關性，以探討FHIT基因及其蛋白在鼻咽癌的診斷及預后判斷中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣東醫學院附屬醫院腫瘤中心二區2011年1月至2013年8月通過鼻內鏡活檢病理確診的鼻咽癌組織54例和鼻咽正常組織28例。進行RQ-RT-PCR檢測的標本貯存于液氮中以便抽提mRNA。另外進行免疫組織化學染色法的標本經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。所有患者均簽署知情同意書，臨床分期采用2008年鼻咽癌分期標準。

1.2 總RNA的提取 將組織在研磨液磨成粉末后，在每50～100 mg組織中加入1 ml Trizol液研磨，研磨液室溫放置5 min，然后以每1 ml Trizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，劇烈搖蕩離心管15 s。吸取上清至一新的離心管，按每1 ml Trizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000×g離心10 min。棄去上清液，按每1 ml Trizol液加入1 ml 75%乙醇的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7 500×g離心5 min。棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10 min。用DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度計計量后置于-70oC編號存放。

1.3 RQ-RT-PCR分析方法 抽提的總RNA進行鑒定后，按Primescript RT Reagent Kit說明進行RNA反轉錄。取RNA反轉錄cDNA產物進行實時定量PCR反應，PCR反應按SYBRPreminxExTaqIIKit說明進行操作，引物由北京生物試劑公司設計并合成：FHIT正向引物：5'-CAACATCTCATCAAGCCCTCT-3'，反向引物：5'-TCCACCACTGTCCCGACT-3'，擴增產物為219bp；β-actin(內參)正向引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物：5'-CTAAG TCATAGTC CGCC TAGAAGCA-3'，擴增產物為186 bp。RT-PCR反應在ABI7300實時定量PCR儀上完成，并選用ddCt相對定量法分析各目標基因的mRNA表達量。其反應循環參數為95°C預變性2 min，95°C變性5 s，60°C延伸31 s，40個循環。

1.4 免疫組織化學染色法

1.4.1 試劑 濃縮型兔抗人FHIT多克隆抗體購自上海朗怡生物技術有限公司，SP試劑盒及DAB顯色液均購自上海朗怡生物技術有限公司。

1.4.2 免疫組織化學染色法 采用免疫組化SP法檢測組織中FHIT蛋白的表達。本試驗采用EnVision二步法進行。步驟如下：切片脫蠟至水；0.3%H2O2甲醇處理切片10 min；水洗；抗原修復；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次1 min；加入一抗體孵育30～60 min；PBS洗3次，每次2 min；加入增強劑孵育20～30 min；PBS洗3次，每次2 min；加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育20～30 min；PBS洗3次，每次2 min；DAB-H2O2孵育5～10 min；PBS洗，水洗；Harris蘇木素染核5～10 min；水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。用已知陽性鼻咽癌組織切片作陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。結果判斷：FHIT陽性表達在胞漿。FHIT的表達以細胞染色強度和細胞陽性百分比之和進行判斷。先按染色強度打分，選擇5個高倍鏡視野(400×)來進行判斷：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色，染色強度需與染色背景相對比，再按陽性細胞百分比打分，0分為0～5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為75%以上。上述兩項之和，0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中度陽性，5～6分為強陽性。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料 54例鼻咽癌患者中男性29例，女性25例，患者年齡30～67歲，中位年齡46歲，其中高中分化癌35例，未分化、低分化癌19例。在28例鼻咽正常組織的對照者中有男性19例，女性9例，患者年齡27～66歲，中位年齡45歲。

2.2 FHIT基因的表達 54例鼻咽癌組織中12例FHIT基因表達陽性(22.2%)，28例鼻咽正常組織中21例FHIT基因表達陽性(75.0%)，FHIT基因的表達水平在鼻咽癌組織中顯著低于正常鼻咽組織，差異有統計學意義(χ2=10.219 5，P＜0.05)。

2.3 FHIT基因的表達與臨床病理特征的關系 依據鼻咽癌患者的年齡、性別、病理分化程度、癌組織的浸潤深度、臨床分期等情況進行分類統計。研究結果發現FHIT基因的表達水平與病理分化程度、臨床分期密切相關(χ2=9.073 7，P＜0.05；χ2=8.141 5，P＜0.05)，與患者的年齡、性別和癌組織的浸潤深度無關(χ2=0.018 3，P＞0.05；χ2=3.218 8，P＞0.05；χ2=0.000 0，P＞0.05)，見表1。

表1 鼻咽癌組織中FHIT基因的表達與臨床病理特征之間的關系(例)

2.4 FHIT蛋白的表達 無論鼻咽癌組織還是正常鼻咽組織，FHIT蛋白主要在細胞漿中表達，少見于細胞核。54例鼻咽癌組織中FHIT蛋白陽性表達的15例(27.8%)，28例鼻咽正常組織中FHIT蛋白陽性表達的18例(64.2%)。結果表明鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達顯著地低于正常鼻咽組織，差異有統計學意義(χ2=10.219 5，P＜0.05)。

2.5 鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達與臨床病理特征的關系 研究結果顯示，FHIT蛋白的表達水平與病理分化程度、臨床分期密切相關(χ2=7.407 0，P＜0.05；χ2=5.026 2，P＜0.05)，與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關(χ2=0.018 3，P＞0.05；χ2=0.331 2，P＞0.05；χ2=0.415 4，P＞0.05)，見表2。

表2 鼻咽癌組織中FHIT蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系(例)

3 討 論

抑癌基因的失活或缺失在腫瘤的發生和發展中具有重要的作用。脆性位點是染色體在特殊條件下易斷裂的非隨意位點。研究表明DNA的不穩定脆性位點可能影響功能基因在染色體區域的定位，并與惡性腫瘤的發生相關聯[2]。FHIT基因位于人類普通型染色體脆性位點FRA3B，是1996年由Ohta等發現的一個抑癌基因。研究證實FHIT基因的失活或者缺失是眾多腫瘤發生發展的一個重要步驟，其中包括肺癌、卵巢癌、胃癌等[3-5]。此外，研究還報道了FHIT基因表達的失活或缺失與多種臨床分期偏晚期、病理分化程度較差的腫瘤的臨床病理特征相關聯，包括：乳腺癌、宮頸癌等[6-7]。目前有關FHIT在鼻咽癌中的表達及其與臨床病理特征的相關性尚未見報道。因此我們進行了相關的研究。

本研究中我們分析了FHIT基因和蛋白在鼻咽癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性。研究結果顯示FHIT基因及其蛋白在鼻咽癌組織中的表達均顯著地低于正常鼻咽組織，且差異均有統計學意義。提示FHIT基因及其蛋白的表達下調或者缺失可能在鼻咽癌的發生中起著重要的作用。另外研究還發現，FHIT基因及其蛋白在鼻咽癌組織中的表達與患者的年齡、性別、癌組織的浸潤深度無關，與病理分化程度、臨床分期密切相關。結果顯示FHIT基因顯著地低表達在病理分化程度較差(低未分化vs高中分化，χ2=5.991，P＜0.05)、臨床分期偏晚期(Ⅲ～Ⅳ期vsⅠ～Ⅱ期，χ2=8.763，P＜0.05)的鼻咽癌組織中，結果同時顯示FHIT蛋白也顯著地低表達在病理分化程度較差(低未分化vs高中分化，χ2=18.567，P＜0.05)、臨床分期偏晚期(Ⅲ～Ⅳ期vsⅠ～Ⅱ期，χ2=6.657，P＜0.05)的鼻咽癌組織中。已有研究報道FHIT基因的失活或缺失在病理分化程度較差和臨床分期較晚期的乳腺癌[6]，非小細胞肺癌[4]組織中更為明顯，這與我們的研究結果相似。因此我們推測FHIT基因與鼻咽癌的發生有關，其表達的下調或者缺失可促進鼻咽癌的發生，且鼻咽癌惡性程度越高，FHIT基因及其蛋白的表達缺失率越高。

總之，本研究提示FHIT基因及其蛋白可能作為鼻咽癌一個重要標志物，它的失活或缺失在鼻咽癌的發生、發展過程中起著一定的作用。檢測FHIT基因及其蛋白將為鼻咽癌的診斷、預后的判斷提供重要的依據。

[1]Ishii H,Vecchione A,Fong LY.Cancer prevention and therapy in a preclinical mouse model:impact of FHIT viruses[J].Curr Gene Ther,2004,4(1):53-63.

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[6]Jeong YJ,Jeong HY,Lee SM,et al.Promoter methylation status of the FHIT gene and Fhit expression:association with HER2/neu statusin breastcancerpatients[J].OncolRep,2013,30(5): 2270-2278.

[7]Du CX,Li SQ,Wang AH,et al.Significance of combined detection of p53 and FHIT in cervical carcinoma diagnosis[J].Eur J Gynaecol Oncol,2014,35(3):298-300.

Expression of FHIT gene and its protein in nasopharyngeal carcinoma tissues and normal nasopharyngealtissues.

LUO Hai-qing,HUANG Jing,YANG Dong-hong,CHEN Zi-hong,YU Zhong-hua.

Oncology Center,AffiliatedHospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of FHIT gene and its protein in nasopharyngeal carcinoma tissues and normal nasopharyngeal tissues,and explore its clinical significance.MethodsThe expression of FHIT gene and its protein was assessed by RQ-RT-PCR and immunohistochemical staining in 54 nasopharyngeal carcinoma and 28 normal nasopharyngeal tissues.ResultsThe expression of FHIT gene was significantly lower in nasopharyngeal carcinoma tissues than that in normal nasopharyngeal tissues(P＜0.05).The expression of FHIT gene and its protein was closely related to differentiation and clinical stage(P＜0.05)and not related to age,gender and tumor invasion depth(P＞0.05).ConclusionFHIT gene and its protein may contribute to clinical diagnosis of nasopharyngeal carcinoma,and it may be a prognostic factor for nasopharyngeal carcinoma.

FHIT;Nasopharyngeal cancer;Gene;Protein;Expression

R739.63

A

1003—6350（2014）24—3640—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1419

2014-04-24)

余忠華。E-mail：zhanghua_yu@126.com